離體培養(yǎng)下的遺傳與變異學時演示文稿第一頁，共七十二頁。（優(yōu)選）離體培養(yǎng)下的遺傳與變異學時第二頁，共七十二頁。離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點體細胞變異的細胞遺傳學基礎體細胞無性系變異誘導與選擇應用體細胞變異的分子遺傳學基礎細胞工程--植物細胞工程第二章離體培養(yǎng)下的遺傳與變異

第三頁，共七十二頁。1離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性2離體培養(yǎng)下變異3影響體細胞遺傳與變異的因素細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第四頁，共七十二頁。離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性：

離體培養(yǎng)的細胞學基礎是有絲分裂，有絲分裂的DNA半保留復制和染色體的均等分裂機制，從理論上可以保證離體培養(yǎng)物在一般情況下的遺傳穩(wěn)定性。在準確選擇培養(yǎng)方式的前提下，離體無性繁殖可以具有較高的遺傳穩(wěn)定性（Phillip等，1994）。正是基于這一理論，利用離體培養(yǎng)技術建立了多種植物的無性繁殖體系。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第五頁，共七十二頁。離體培養(yǎng)中的遺傳穩(wěn)定性：

離體培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性表現(xiàn)的另一個方面是即使發(fā)生某些變異，只需根據(jù)需要選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)方式進行離體繁殖，即可以淘汰或選擇變異、或分離純合體。離體培養(yǎng)下的變異均屬于無性變異，即使變異發(fā)生，從個體的角度講只會發(fā)生在少數(shù)性狀上，因此，很容易從群體中剔除變異個體，從而可以維持離體培養(yǎng)群體的遺傳穩(wěn)定性?？焖俜敝臣词遣捎眠@一技術途徑來保持所繁殖對象的品種典型性。變異也可以通過離體培養(yǎng)選擇保留并快速純化，這亦是離體培養(yǎng)遺傳穩(wěn)定性利用的途徑之一。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第六頁，共七十二頁。離體培養(yǎng)下變異特點：

變異的普遍性變異的局限性（特點）嵌合性細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第七頁，共七十二頁。部分植物離體培養(yǎng)再生植株的表型變異頻率植物種類再生植株來源變異頻率(%)煙草體細胞愈傷組織10水稻胚愈組織71.9甘蔗幼葉愈傷組織>18玉米體細胞愈傷組織14大麥花粉植株10-15馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體100菠蘿冠芽愈傷組織7

腋芽愈傷組織34

幼果愈傷組織100細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第八頁，共七十二頁。離體培養(yǎng)下變異特點：

就單個變異體來講，離體培養(yǎng)中變異性狀往往是單一的，或少數(shù)幾個性狀的變異。分析水稻種子愈傷組織起源的植株變異顯示，在來自75個愈傷組織的1121個再生植株中，發(fā)生變異的植株，與供體品種比較只有1個性狀表現(xiàn)差異的占72％，2個以上性狀表現(xiàn)差異的只占28％。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第九頁，共七十二頁。離體培養(yǎng)下變異特點：就同一培養(yǎng)體系的再生群體而言，變異又具有多樣性。黑云杉(shan)（P.mariana）65個系的7047個體細胞胚植株和白云杉（P.glauca）22個系的3995個體細胞植株的表型變異分析顯示，盡管兩個種的體細胞胚植株變異頻率分別只有1.0%和1.6%，但分析發(fā)生變異的植株變異范圍確較大，按形態(tài)變異即可分為9類，僅在矮化型變異一個性狀上也表現(xiàn)出一系列程度上的顯著不同，生長4－5年后其植株高度呈現(xiàn)一系列變異類型，一些極度生長限制型矮化的株高只有幾厘米，最矮類型的株高只有2－3cm，細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十頁，共七十二頁。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點云杉體細胞胚植株變異類型第十一頁，共七十二頁。與有性重組相比，體細胞突變性狀具有一定局限性：從表型上看，在不同植物類型中經(jīng)常發(fā)生的變異主要是植株形態(tài)（株高、葉形、葉色等）、生長勢、育性、某些抗性等性狀的變異。從生理生化特性上看容易出現(xiàn)同功酶譜、次生代謝的消長等變異。一些單基因控制的性狀不僅發(fā)生隱形突變，也發(fā)生顯性突變。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十二頁，共七十二頁。嵌合性嵌合性是指同一有機體中同時存在有遺傳組成不同的細胞，它是組織培養(yǎng)中常見的現(xiàn)象。實際上，愈傷組織在大多數(shù)情況下是一種具有不同染色體數(shù)和遺傳變異程度不同的細胞組成的嵌合體，這些細胞各自進行不同步的分裂。

細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十三頁，共七十二頁。

硬粒小麥(Triticumdurum)6個無性系植株體細胞染色體數(shù)(括號外為個體數(shù)，括號內(nèi)為染色體數(shù))序號2n<142n=142n=15～272n=282n=29～552n=562n>5811(7)737(16～24,26)768(29,39,40)422

35(17,20,23)111(33)

135(9,11,12)621(15,18,21～27)333

43(7)14(16,21,22,27)223

51(11)65(15,22,26)141(32)

62(12)118(18,20～26)211(40)

2細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十四頁，共七十二頁。非遺傳變異（epigeneticvariation）外遺傳變異：不設計基因結構的變化，只是在基因表達水平上的差異，它是細胞內(nèi)原有遺傳物質(zhì)潛力在離體培養(yǎng)中誘導表達的結果，如最常見的生長素自養(yǎng)型變異。這種基因調(diào)控水平上的變異不能通過有限世代傳遞給后代植株，但在離體培養(yǎng)中卻可以經(jīng)過培養(yǎng)繼代，長期保存下來，只要不經(jīng)過有性過程，這些性狀一般不會丟失。生理適應性變異：通常在某種外界條件存在時才表現(xiàn)出變異。當外界條件不存在時，變異隨之消失。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十五頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

供體植物培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式繼代培養(yǎng)的次數(shù)細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十六頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

供體植物的遺傳背景對體細胞變異具有直接影響。供體植株原有的倍性水平在培養(yǎng)細胞多倍化過程中起著重要作用，處于二倍體水平上的細胞比處于單倍體水平上的細胞較為穩(wěn)定。植物種內(nèi)基因型間變異頻率差異較大。Tremblay等（1999）比較研究黑云杉和白云杉體細胞變異時也顯示，黑云杉中體細胞變異頻率最大的基因型可達57.6％，而有些基因型變異率則為0。白云杉種內(nèi)不同基因型的體細胞變異，變異率最高的基因型可達42.6％，而有些基因型則根本不發(fā)生變異。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十七頁，共七十二頁。

谷子體細胞無性系R2的變異頻率基因型R2株系數(shù)未變異株系變異株系總變異％株系數(shù)％穩(wěn)定變異％分離變異％豫谷1號豫谷5號高39鄭407冀谷14號C445矮寧黃210120170121557010020110415211039478395.786.789.490.970.967.183.0053340604.282.57.306.09111581223114.39.18.86.621.832.911.04.313.310.69.129.132.917.0細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十八頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

以分生組織為外植體的再生植株通?？梢跃S持供體植物的典型性，體細胞變異頻率很低。在分化組織中，由于細胞分化過程中的核內(nèi)有絲分裂或核內(nèi)復制，其結果是在活體內(nèi)組織分化期間就會出現(xiàn)體細胞多倍性。在植物體內(nèi)，這些多倍性細胞在正常情況下不再發(fā)生分裂以維持正常分化細胞的功能，然而在離體培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)基中的激素以及培養(yǎng)環(huán)境，就有可能刺激這些多倍性細胞分裂，進而分化形成多倍體植株。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第十九頁，共七十二頁。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點影響體細胞遺傳與變異的因素：

供體植物對體細胞變異的影響還體現(xiàn)在組織細胞的生理狀態(tài)上。不同組織細胞由于存在發(fā)育時期和生理功能的差異，因而在細胞的理化水平以及細胞所處的后遺傳狀態(tài)均有較大差異。在多年生植物培養(yǎng)中，供體樹的年齡與體細胞變異也有一定關系，變異頻率有隨樹齡的增加而增高的趨勢。第二十頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

普遍認為，培養(yǎng)方式、激素以及其它附加成分均會誘導體細胞變異的發(fā)生，因為離體培養(yǎng)本身可能即是一種變異誘導的過程。培養(yǎng)基激素濃度和不同激素配比對再生植株的染色體倍性有一定影響。在豌豆根段培養(yǎng)物和細胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，2，4－D0.25mgL-1能增加多倍體細胞的有絲分裂，減少二倍體細胞的有絲分裂，而高濃度（20mgL-1）則能促進二倍體細胞的分裂。在0.02mgL-1激動素和1mgL-1NAA的培養(yǎng)基上建立起來的纖細單冠菊幼苗愈傷組織，保存80天以后，其中多數(shù)細胞為二倍體，少數(shù)為四倍體。將這些愈傷組織轉移到含不同激素水平的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)其多倍體細胞的分裂頻率不同。0.02mgL-1激動素和4mgL-1NAA的多倍體分裂頻率為20％，而0.02mgL-1激動素和1mgL-1NAA時的多倍體分裂頻率為100％。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是因為多倍體細胞通常具有較強的環(huán)境忍耐能力，能夠通過一些自體調(diào)節(jié)使細胞分裂。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第二十一頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

激素除了引起染色體倍性的增加外，在一些培養(yǎng)中還發(fā)現(xiàn)染色體倍性減少的現(xiàn)象。首次報道培養(yǎng)過程中的染色體減數(shù)是在1948年（Huskins，1948），以后一些研究者在他們的工作中也相繼發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象，但有關體細胞倍性減數(shù)的資料還十分有限。顧蔚（1999）在蠶豆組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，體細胞染色體減數(shù)與使用極端的激素濃度有關，在他的試驗中不含激素的培養(yǎng)基其多倍體發(fā)生頻率為6.31％，在10mgL-1NNA和2.5mgL-1KT的培養(yǎng)基中，單倍體發(fā)生頻率可達13.03％。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第二十二頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

除了培養(yǎng)基的外源激素可以引起變異外，培養(yǎng)基的物理狀態(tài)以及培養(yǎng)類型也會引起細胞的變異。一般來講，懸浮培養(yǎng)的細胞較半固體培養(yǎng)的細胞易產(chǎn)生變異。原生質(zhì)體培養(yǎng)的體細胞變異大于細胞培養(yǎng)的變異，而細胞培養(yǎng)的變異又大于組織器官培養(yǎng)的變異。在細胞培養(yǎng)中，性細胞培養(yǎng)再生植株的變異要大于體細胞培養(yǎng)的植株。馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的變異達到100％，而莖尖培養(yǎng)再生植株基本沒有變異。在因培養(yǎng)類型引起的變異中，不僅有染色體倍性的異常變異，同時基因突變、染色體結構變異、以及非DNA水平引起的變異亦相繼增加。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第二十三頁，共七十二頁。影響體細胞遺傳與變異的因素：

由繼代次數(shù)引起的體細胞變異幾乎在各種類型的植物中均有報道。一般來講，繼代時間越長，繼代次數(shù)越多，細胞變異的機率就越高。煙草繼代培養(yǎng)5年的愈傷組織，其再生植株與供體基因型相比，幾乎沒有形態(tài)正常的植株。染色體分析顯示，這些植株大多為非整倍體和多倍體。玉米從剛誘導的愈傷組織中分化的植株，在形態(tài)上與供體基因型基本一致，但培養(yǎng)3年后愈傷組織的再生能力顯著下降，再生植株生長異常，細胞學分析顯示出染色體斷裂和帶型變異。細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點第二十四頁，共七十二頁。

培養(yǎng)時間對掌葉半夏愈傷組織染色體變異的影響培養(yǎng)時間（月）觀察細胞數(shù)亞二倍體二倍體多倍體和非整倍體細胞數(shù)％細胞數(shù)％細胞數(shù)％13121892515083146152915.211.830.034.96539273370.776.554.039.8967199.811.814.022.9細胞工程--植物細胞工程2.1離體培養(yǎng)中的遺傳與變異特點在培養(yǎng)初期的１～３個月內(nèi)，愈傷組織的染色體變異頻率顯著低于培養(yǎng)時間超過１２個月以上的愈傷組織。第二十五頁，共七十二頁。

離體培養(yǎng)的體細胞變異，從本質(zhì)上來說是細胞對環(huán)境壓力的應答機制的調(diào)整。有學者認為，實現(xiàn)這一機制調(diào)整的始發(fā)點是放棄自然條件下的細胞學控制程序，重建新的細胞學控制程序，這種程序重建的結果導致了染色體數(shù)量和結構的改變（Phillips等，1994）。

細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第二十六頁，共七十二頁。DNA重復復制染色體斷裂與重組非正常有絲分裂細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第二十七頁，共七十二頁。DNA核內(nèi)重復復制(endoreduplication）：DNA重復復制但不發(fā)生細胞分裂，其結果是染色體組數(shù)增加，形成同源多倍體。如果這種DNA重復復制多次發(fā)生，細胞內(nèi)DNA含量就會不斷上升。Salon和Earle（1998）在硬粒小麥(Tripsacumdactyloides)的非成熟胚培養(yǎng)中觀察到，存活的再生植株均為二倍體和四倍體，加倍后的植株在形態(tài)和發(fā)育方面均很正常。

DNA的核內(nèi)再復制在有些情況下可以反復進行。D’Amato等（1980）報道，紅花菜豆（Phaseoluscoecineu，2n＝22）幼胚離體培養(yǎng)形成的愈傷組織，正常二倍體細胞只占二分之一，由于DNA核內(nèi)多次復制，有的細胞核內(nèi)DNA值達到128c。

細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第二十八頁，共七十二頁。DNA核內(nèi)重復復制(endoreduplication）：一些中間類型的倍數(shù)性的形成，有研究認為可能是由于DNA經(jīng)過重復復制后，在以后的復制中出現(xiàn)非同步復制或核融合所致。如第一次DNA復制沒有發(fā)生分裂的4n核，在此后的分裂進程中，與正常分裂的2n核發(fā)生融合，從而形成六倍體（張冬生，1989）。

細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第二十九頁，共七十二頁。

硬粒小麥中胚軸培養(yǎng)中DNA值的變化培養(yǎng)天數(shù)不同DNA值細胞比例（％）<2c2c～4c<8c8c或>8c0

88.311.7

5

80.716.82.5134.879.56.69.1179.781.57.90.9細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十頁，共七十二頁。DNA核內(nèi)重復復制(endoreduplication）：近年研究顯示，DNA核內(nèi)重復復制的發(fā)生與細胞分裂周期的調(diào)控有關。在離體條件下，一些進入S期的細胞，在完成DNA復制后不進入下一階段完成分裂，從而使細胞內(nèi)DNA值和染色體倍性增加一倍。這種細胞進入間期后又開始DNA合成，如果分裂能正常進行，則由此而產(chǎn)生的細胞即為四倍體。如果分裂仍然不能進行，則DNA值和染色體倍性就會再增加一倍，從而使細胞內(nèi)DNA值和染色體倍性成2n形式增加。玉米胚乳和子葉發(fā)育研究顯示，DNA重復復制可能與M期的不同CDK活性有關，而此時的CDK活性又受到磷酸化和去磷酸化的影響。同時，在玉米中還發(fā)現(xiàn)了CDK的抑制子CKI，DNA核內(nèi)復制通過CDK的調(diào)控在動物發(fā)育和病理細胞中已被證實。因此，Larkins等認為，這一機制可能是DNA核內(nèi)重復復制的重要調(diào)控途徑。細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十一頁，共七十二頁。DNA核內(nèi)重復復制(endoreduplication）：擬南芥髓組織、成熟葉片以及托葉細胞多倍體發(fā)生過程的研究顯示，一個在G2期表達的CDK基因CKS1At參與調(diào)節(jié)了DNA重復復制過程（Jacqmard等，1999）。此外，Cebolla等（1999）在他們的研究中發(fā)現(xiàn)，一個與Cyclins降解有關的基因ccs52也與DNA重復復制和多倍體細胞產(chǎn)生有關?，F(xiàn)有資料顯示，DNA的核內(nèi)重復復制可能涉及到一些與細胞周期調(diào)控基因的開啟與關閉。

細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十二頁，共七十二頁。染色體斷裂與重組：染色體結構變異是體細胞變異的另一重要類型；染色體斷裂與重組是離體培養(yǎng)中染色體結構變異的主要原因之一，也是體細胞變異中經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象；其細胞學特征是分裂中期出現(xiàn)斷裂的染色體片段、落后染色體以及染色體橋，其結果是在體細胞中出現(xiàn)染色體易位、缺失、倒位等多種類型的結構變異。細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十三頁，共七十二頁。染色體橋落后染色體細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎染色體斷裂與重組：向日葵不對稱體細胞雜種后代細胞分裂中染色體非正常行為第三十四頁，共七十二頁。染色體斷裂與重組：近年的研究認為，染色體斷裂與DNA甲基化程度有關。增加DNA甲基化，亦會引起染色體斷裂。分析認為，甲基化程度的增加可能抑制DNA的復制效率，使得DNA復制不能同步，從而造成后期橋的產(chǎn)生和染色體的斷裂。染色體結構變異既可發(fā)生在愈傷組織細胞中，也可發(fā)生在再生植株中，有時在一些再生植株的有性后代中也能觀察到。產(chǎn)生染色體結構變異的再生植株一般生長不正常，生活力低下，很難長期生存，因此以保存種質(zhì)資源為目的的離體培養(yǎng)應盡可能避免這種變異發(fā)生，以免造成基因資源流失。細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十五頁，共七十二頁。染色體非正常有絲分裂：離體培養(yǎng)中，染色體除了整倍性變異外，還可觀察到大量的非整倍性變異，這種愈傷組織往往分化能力低下，再生植株大多生長不正常，有性繁殖遺傳穩(wěn)定差。細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十六頁，共七十二頁。紡錘體形成異常使得有絲分裂不正常是其原因之一。細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎染色體非正常有絲分裂：第三十七頁，共七十二頁。染色體非正常有絲分裂：核裂經(jīng)常導致雙核與多核細胞的出現(xiàn)。在紅花菜豆的胚培養(yǎng)愈傷組織中，雙核細胞有70％有核裂現(xiàn)象，蠶豆子葉誘導的愈傷組織細胞的雙核和多核細胞出現(xiàn)的頻率也相當高。在核裂出現(xiàn)頻率高的材料中，多倍體、亞多倍體和非整倍體細胞的出現(xiàn)頻率亦相應提高。細胞工程--植物細胞工程2.2體細胞變異的細胞遺傳學基礎第三十八頁，共七十二頁。體細胞變異除了發(fā)生在染色體水平上，更多的是在基因水平上的變異。從利用體細胞變異的角度看，染色體變異大多是一些畸形變異，真正可利用的染色體變異是十分有限的?；蛩缴系淖儺愒诒硇蜕洗蠖嘀皇莻€別性狀的改變，不會影響再生植株的正常生長發(fā)育，因此，從再生植株的這些變異中就有可能篩選出有益的變異。基因水平上的變異從根本上講就是DNA水平上的堿基突變或修飾狀態(tài)的改變。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第三十九頁，共七十二頁。１堿基突變２DNA序列的選擇性擴增與丟失３轉座子活化４DNA甲基化細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十頁，共七十二頁。堿基突變：堿基突變是指DNA序列中堿基的改變。突變堿基的DNA序列處于結構基因的位置或調(diào)控序列的位置時，即可導致遺傳狀態(tài)的改變。堿基突變是產(chǎn)生體細胞變異的重要途徑之一。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十一頁，共七十二頁。堿基突變：對于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變可以穩(wěn)定遺傳而且符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，這一點已在水稻、煙草和玉米的體細胞變異中得以證實。Brettell等從645株玉米雜種胚培養(yǎng)再生植株中，發(fā)現(xiàn)了一個穩(wěn)定突變體Adh1（乙醇脫氫酶突變體），克隆基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因第七外顯子中一個編碼谷氨酸的GAG中的A轉換成為了T，使翻譯肽鏈中的谷氨酸轉變?yōu)槔i氨酸。植物的許多性狀，特別是經(jīng)濟性狀，均由多基因控制，對于多基因控制性狀的堿基突變可能由于技術上的復雜性，目前還沒有關于多基因控制性狀的堿基突變報道。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十二頁，共七十二頁。DNA序列的選擇性擴增與丟失：早在上世紀80年代Larkin和Scoworoft即提出，DNA序列的擴增與丟失也是體細胞無性系變異的原因之一。早期的研究認為，DNA值的改變與倍性變異是一致的。但近年來的研究顯示，DNA值的變化是一個比較復雜的分子生物學現(xiàn)象。當DNA的c值以整倍性形式增加或減少時，其變化與染色體倍性的變異是一致的。然而，有些DNA值的變化卻與倍性沒有直接聯(lián)系，這種變化大多是DNA序列的選擇性擴增或部分序列丟失造成在原核染色體中，DNA的量或真核細胞中單倍體DNA的量，稱為C值；C值與生物結構與組成的復雜性不一致的現(xiàn)象，稱為C值矛盾。離體培養(yǎng)下DNA序列的選擇性擴增包括兩種情況，一是重復序列的擴增，二是基因的選擇性擴增。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十三頁，共七十二頁。DNA序列的選擇性擴增與丟失：Lapitan等（1988）以生物素標記的480bp重復序列DNA片段為探針，發(fā)現(xiàn)小黑麥雜種再生植株當代7R染色體短臂端粒位置上的這種重復序列發(fā)生了選擇性擴增，而且這種擴增可以遺傳至少三代。在水稻、小麥等作物中也發(fā)現(xiàn)一些微衛(wèi)星DNA的擴增。水稻懸浮培養(yǎng)細胞的DNA分析發(fā)現(xiàn)，未分化的培養(yǎng)細胞中一些高度重復序列的擴增比供體材料高75倍，而不同品種的葉片這種擴增差異只有2－3倍。亞麻衛(wèi)星DNA和小麥rDNA研究中也有類似現(xiàn)象。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十四頁，共七十二頁。DNA序列的選擇性擴增與丟失：基因的選擇性擴增在植物個體發(fā)育中經(jīng)?？吹?。離體培養(yǎng)下的基因選擇性擴增被認為是細胞在短期內(nèi)為滿足某種需要而產(chǎn)生足夠的基因產(chǎn)物的一種調(diào)控手段?？钩輨┎莞柿椎耐蛔兿稻褪且粋€典型的例子。草甘磷能抑制3-烯醇丙酮酸莽草酸鹽-5-磷酸合成酶（EPSPs）活性，抗草甘磷突變體則具有較高EPSPs活性。DNA分析顯示，這種突變體的EPSPs活性提高是因為參與編碼該酶的基因選擇性擴增，增加了mRNA水平，從而增加了酶的含量。Peter等的研究顯示，在煙草抗草甘磷的突變體中，至少有2個與EPSPs合成相關的基因發(fā)生了選擇性擴增，而且這些突變體在沒有草甘磷選擇壓力存在的情況下仍富含EPSPsmRNA。

細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十五頁，共七十二頁。DNA序列的選擇性擴增與丟失：在離體培養(yǎng)中，有時也會發(fā)生DNA序列丟失的現(xiàn)象?，F(xiàn)有資料顯示，DNA序列丟失多發(fā)生在rDNA及其它們的間隔序列，某些重復序列DNA區(qū)域也易發(fā)生丟失。Landsmann利用DNA隨機克隆首先在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)了再生植株有DNA片段的丟失，隨后Cullis和Clary采用類似的方法在亞麻再生植株中觀察到rDNA的減少。以后在大麥、小麥以及水稻的培養(yǎng)再生植株中均檢測到rDNA的減少。DNA的減少不僅發(fā)生在核DNA中，也有發(fā)生在葉綠體基因組中。一些DNA序列的減少只發(fā)生在愈傷組織形成階段，再生植株過程中又恢復到正常狀態(tài)，目前還不清楚這種變化的生物學意義。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十六頁，共七十二頁。轉座子活化:上個世紀80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，轉座因子的活化可能是體細胞無性系變異的原因之一。因為培養(yǎng)中細胞快速分裂，異染色質(zhì)復制滯后，引起細胞分裂后期形成染色體橋和染色體斷裂。在斷裂部位的DNA修復過程中，位于異染色質(zhì)區(qū)的轉座子被活化繼而轉座，引起一系列的結構基因活化、沉默以及位置變化，造成無性系變異。我國學者朱至清認為，也可能是轉座子在培養(yǎng)環(huán)境中首先被激活而轉座，從而造成染色體的結構變異。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十七頁，共七十二頁。轉座子活化:無論離體培養(yǎng)中轉座子轉座與染色體變異的過程如何，離體培養(yǎng)中轉座子引起的體細胞變異是存在的。Peschke等以玉米Ac轉座子測驗系為母本，與1200個由未成熟胚再生的植株進行測交，根據(jù)種子糊粉層顏色色素的變化來確定再生植株中是否攜帶有活化的Ac轉座子，結果在56株中檢測出Ac活化。苜宿組織培養(yǎng)再生植株中也觀察到因轉座子活化所引起的花色變異。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十八頁，共七十二頁。轉座子活化:利用Ds轉座子系統(tǒng)進行異源轉化，在一些作物中成功觀察到轉座子插入的體細胞突變，從而證明轉座因子確實誘導了體細胞變異。Mckenzie等為了建立一個穩(wěn)定的轉座子標簽體系，將Ds/Ac轉座系統(tǒng)導入球莖甘藍中，獲得的攜帶有轉座系統(tǒng)的轉化植株，在離體培養(yǎng)下增加選擇壓力，篩選穩(wěn)定的轉座子插入突變，結果觀察到在獲得到42個Ac切除的穩(wěn)定Ds插入再生植株中，有29個植株發(fā)生了Ds再轉座。足跡分析顯示，在DsDonor-site序列附近發(fā)生了大量的缺失和重組。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第四十九頁，共七十二頁。DNA甲基化:DNA甲基化在基因表達調(diào)控中具有重要作用。DNA甲基化和去甲基化，不僅能通過調(diào)控基因的表達與關閉來控制生物的發(fā)育，同時也可以通過DNA甲基化途徑來適應環(huán)境對生物體的壓力。目前甲基化研究主要利用HpaII和MspI兩種甲基化敏感的限制性核酸內(nèi)切酶進行比較分析。HpaII和MspI的酶切位點均為CCGG，當靠外的C被甲基化時，只能被HpaII酶切，當靠內(nèi)的C被甲基化時，只能被MspI酶切，在一般情況下，與G相鄰的C更容易被甲基化。利用兩種酶切片段的差異即可分析DNA甲基化的變化。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第五十頁，共七十二頁。DNA甲基化:離體培養(yǎng)再生植株的甲基化變化首先在玉米體細胞無性系再生植株中發(fā)現(xiàn)。來自玉米幼胚再生植株的某些無性系與供體相比發(fā)生了超甲基化，而另一些再生植株卻只在與G相鄰的C上發(fā)生甲基化，而且這種甲基化在基因組中的分布不均勻。胡蘿卜、番茄、馬鈴薯等多種植物的培養(yǎng)細胞或再生植株中，均報道發(fā)現(xiàn)了因DNA甲基化改變而產(chǎn)生的體細胞變異。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第五十一頁，共七十二頁。DNA甲基化:Kova?ik等在煙草細胞懸浮系“TBY-2”培養(yǎng)中，觀察到由于滲透壓的改變，細胞DNA出現(xiàn)了超甲基化的現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中加入NaCl或者甘露醇提高培養(yǎng)基滲透壓，然后提取細胞DNA檢測DNA甲基化變化情況。結果發(fā)現(xiàn)，在煙草基因組的2個異染色質(zhì)區(qū)（HRS60和GRS），其CCG三核苷酸重復區(qū)和CCGG四核苷酸重復區(qū)的C幾乎全部被甲基化。當把細胞轉移培養(yǎng)到滲透壓正常的培養(yǎng)基中時，DNA甲基化程度又可恢復正常。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第五十二頁，共七十二頁。去DNA甲基化:離體培養(yǎng)中的某些變異也為DNA甲基化程度的降低所致，最典型的例子是油棕體細胞胚植株的雄蕊雌性化變異。Rival等發(fā)現(xiàn)油棕體細胞胚植株中，大約有5％的植株表現(xiàn)出雄蕊雌性化和完全不育。進一步研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生這種變異的愈傷組織有兩種類型，一種是瘤狀愈傷組織（NCC），另一種是快速生長愈傷組織（FGC）。來自NCC的變異植株，在種植9年后，所有植株均可恢復正常。而來自FGC的變異植株只有50％能恢復正常。進一步分析顯示，變異植株DNA甲基化程度分析顯示，來自NCC的變異植株，C的甲基化率比正常植株減少了0.5～2.5％。而來自FGC的變異植株，C的甲基化率比正常植株減少了4.5％細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎第五十三頁，共七十二頁。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞變異的分子遺傳學基礎體細胞變異可以發(fā)生在培養(yǎng)的不同階段，如愈傷組織階段、器官發(fā)生階段等。因此，體細胞變異可以在愈傷組織水平上表現(xiàn)，也可以在植株再生過程中出現(xiàn)變異。但是，一些愈傷組織發(fā)生變異后可能難以再生植株，因而有些變異不可能在形態(tài)發(fā)生中表現(xiàn)。所以，一般情況下，愈傷組織的變異比再生植株的變異頻率更高。此外，體細胞變異還表現(xiàn)在再生植株的有性繁殖后代中。有些變異可能要通過有性世代才能表現(xiàn)或穩(wěn)定，這也是體細胞無性系變異育種選擇的基本過程。第五十四頁，共七十二頁。體細胞無性系變異的篩選有以下一些明顯的優(yōu)點：可以在小空間內(nèi)對大量個體進行選擇。篩選可以在幾個細胞周期內(nèi)完成，且不受季節(jié)限制。因為試驗在人工培養(yǎng)條件下進行，因此誘變和篩選條件可以根據(jù)需要進行調(diào)節(jié)和控制，從而提高了試驗的重復性。由于變異是在單細胞水平上進行的，因此，一個突變體就是來自一個細胞，不會有非突變細胞的干擾，避免了整體植株水平上無性變異常呈現(xiàn)出的嵌合體。在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，誘變劑可較均勻的接觸細胞，因此可以引起培養(yǎng)細胞相對較高頻率的發(fā)生突變，增加了選擇機會。

細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第五十五頁，共七十二頁。體細胞無性系變異的表示方法主要有兩種：一種是Chaleff提出的以R0、R1、R2、…分別代表體細胞無性系變異的當代和自交以后的世代；另一種是由Larkin和Scowcroft提出的以SC1、RC2、RC3、…來分別代表體細胞無性系變異的當代和自交以后的世代。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第五十六頁，共七十二頁。１誘變材料的選擇２自發(fā)變異３細胞誘變４突變體篩選５體細胞變異的應用細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第五十七頁，共七十二頁。誘變起始材料的選擇：選擇起始材料需考慮以下幾方面的問題:其一，目標性狀的可行性。體細胞突變性狀是個別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過誘變改變個別不良性狀是體細胞突變系選擇的目的。其二，必需充分考慮試驗植物的細胞培養(yǎng)技術水平。其三，適當?shù)募毎愋鸵嗍求w細胞突變系篩選效率的重要條件。如原生質(zhì)體、單細胞、小孢子等有較高的誘變頻率。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第五十八頁，共七十二頁。誘變起始材料的選擇：雖然各種狀態(tài)下的培養(yǎng)細胞均可以作為分離突變細胞的來源，但實踐中原生質(zhì)體和懸浮細胞系常常被首先考慮作為起始材料。由于原生質(zhì)體可以實現(xiàn)真正意義上的單細胞突變，因而它是體細胞變異的首選起始材料。但原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術具有一定難度，選擇時必須充分考慮該植物的原生質(zhì)體培養(yǎng)技術的成熟程度?；钴S生長的細胞懸浮系具有較大比例的單細胞或呈小細胞團，且培養(yǎng)技術簡單、易操作，是較為理想的起始材料。植物單倍體性細胞、特別是二倍體植物的性細胞作為誘變材料，因為等位基因位點的干擾小、誘變概率大，且獲得突變體后容易通過人工加倍純合穩(wěn)定，使某些隱性變異更容易利用，也是較理想的起始細胞。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第五十九頁，共七十二頁。自發(fā)突變：離體培養(yǎng)再生植株的自發(fā)變異比自然條件下的變異要高得多，一般可高出幾百甚至上千倍。體細胞無性系自發(fā)變異頻率既與培養(yǎng)物的遺傳背景、外植體類型及培養(yǎng)類型有關，同時也受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分等因素的影響。一般來講，長期營養(yǎng)繁殖的植物、培養(yǎng)時間較長或繼代次數(shù)多等，均容易出現(xiàn)較高的變異率。另外，培養(yǎng)類型中，原生質(zhì)體、細胞、愈傷組織培養(yǎng)等所出現(xiàn)的變異頻率要高于組織或器官培養(yǎng)的變異。

離體培養(yǎng)中體細胞自發(fā)突變產(chǎn)生的變異比較穩(wěn)定，沒有人工誘變的后續(xù)干擾，有利于分離培養(yǎng)。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第六十頁，共七十二頁。物理誘變化學誘變轉座子插入

三.誘變細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第六十一頁，共七十二頁。物理誘變：常用的射線處理包括：X射線、γ射線、快中子、紫外線等。選擇輻射類型應根據(jù)培養(yǎng)類型進行。以組織器官為誘導材料，可以選擇輻射強度較大的γ射線、快中子等進行輻射。以細胞或原生質(zhì)體，則可以選擇X射線、紫外線等。特別是以原生質(zhì)體為誘導材料時，可以使用紫外線照射，因為常用紫外線的波長為270nm，與DNA吸收波長260nm相近，而原生質(zhì)體因為沒有細胞壁的屏障，對紫外線的敏感性較強，從而可以達到較好的誘變效果。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第六十二頁，共七十二頁?；瘜W誘變：常用的化學誘變劑主要有：烷化劑（硫酸二乙酯DES、乙基磺酸乙酯EES、甲基黃酸乙酯EMS、環(huán)氧乙烷EO、乙烯亞胺EI），此類誘變劑有一個或多個活化烷基，可與DNA分子中的堿基或磷酸基結合，改變DNA的結構而引起突變；堿基類似物（5－溴尿嘧啶是胸腺嘧啶類似物、2－氨基嘌呤是腺嘌呤類似物），在細胞內(nèi)核酸復制時，這些類似物可以摻入到新合成的DNA分子中引起錯配；移碼誘變劑，如ICR化合物和吖啶類似物等。此外亞硝酸、羥胺等某些抗菌素等亦可引起突變產(chǎn)生。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第六十三頁，共七十二頁。轉座子插入誘變：轉座子插入誘變是近年來利用分子生物學技術發(fā)展起來的新的體細胞變異誘導方法。轉座子既可直接將外源基因帶入細胞內(nèi)獲得新性狀，又可以獨立插入通過其轉座功能誘導變異。目前，使用較多的轉座子體系主要是玉米的Ac/Ds系統(tǒng)，其主要操作過程是首先采用基因轉化的方法將Ac/Ds導入受體細胞，再通過體細胞培養(yǎng)或再生植株的自交或測交使Ac因子切除，由于轉座子插入的隨機性，即可在切除Ac的植株中篩選出不同變異。利用這一途徑已在苜宿、馬鈴薯、番茄、甘藍等多種植物上獲得可利用的體細胞變異植株。細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第六十四頁，共七十二頁。直接篩選間接篩選突變體的選擇：細胞工程--植物細胞工程2.3體細胞無性系變異誘導與選擇應用第六十五頁，共七十二頁。突變體的選擇——直接選擇：其方法是用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細胞能夠生長，非突變細胞不能生長，從而直接篩選出突變體。如抗除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲透壓的物質(zhì)。目前采用這一途徑，已從多種植物中篩選出可利用的