總大腸菌群/大腸埃希氏菌

及耐熱(糞)大腸菌群

固定底物技術酶底物法微生物檢測的重要性地震等自然災害過后水體中會被大量微生物所污染，特別是糞便污染，如水體中含有腸道病原菌株，并被人飲用則會爆發(fā)嚴重疾病如泌尿系感染、菌血癥和腦膜炎，少數(shù)腸道病原菌株可引起急性腹瀉。通常人們用投放含氯消毒劑進行消毒，但消毒效果如何還需要通過檢測水體中是否含有總大腸菌群和大腸埃希氏菌來判斷。指示菌的方法學定義總大腸菌群（TotalColiforms)

大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，具有指標菌的一般特征故以此作為糞便污染指標評價飲水的衛(wèi)生質量。耐熱大腸菌群(ThermotolerantColiforms)，原名：糞大腸菌群（FecalColiforms)

用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分開，在44.5℃仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群。是水體受人畜糞便污染的比較直接指標。大腸埃希氏菌（大腸桿菌，E.Coli.)

大腸埃希氏菌是指能產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培養(yǎng)液呈黃色，能產生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培養(yǎng)液在波長366nm紫外光下產生熒光的細菌。大腸埃希氏菌是糞大腸菌群的組成部分，是水體受人畜糞便污染的最直接指標，水中含有大腸埃希氏菌提示有糞便污染。

目前的糞大腸菌群檢測方法是實際上是檢測耐熱大腸菌群而不是大腸埃希氏菌。

有關文獻報道的試驗結果表明,有15%的陽性耐熱糞大腸菌群實際上屬于總大腸菌群而不是大腸埃希氏菌。這種情況的發(fā)生多數(shù)是由于耐熱的克雷伯氏菌普遍存在于自然環(huán)境中，而非來源于人畜糞便，因此與人類疾病的產生也沒有絕對的關聯(lián)。

同時，（用上述方法檢測）會有10%的假陰性結果，是因為大腸埃希氏菌屬有10％不會產氣（注1）。

注1：目前的糞大腸菌群檢測方法，產酸產氣是預試驗的陽性判斷指標。糞便污染指示菌比較

我國水質微生物指標(細菌)

檢測方法多管發(fā)酵法（MultipleTubeFermentation,MTF)濾膜法（MembraneFiltration,MF)固定底物技術酶底物法(DefinedSubstrateTechnology,DST)酶底物法(EnzymeSubstrateTest,EST)

檢測方法濾膜法（membranefiltration,MF)—共需2-3天時間用孔徑為0.45μｍ的微孔濾膜過濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)后，計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù),計數(shù)單位為菌落形成單位CFU(colonyformingunit)儲備培養(yǎng)基的制備>過濾（需器械滅菌等）>培養(yǎng)（22-24H）

陰性結果(無典型菌落）

革蘭氏染色鏡檢

觀察菌落形態(tài),挑取特征菌落

證實試驗（培養(yǎng)24±2h，有產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在）

酶底物法大腸埃希氏菌陽性反應原理

β-葡萄糖醛酸酶4-甲基-傘形葡萄糖苷酸科立得

應用飲用水

源水

瓶裝水

再生水

廢水

食品水畜牧用水

醫(yī)療用水

收錄于“標準測試法”內

–APHA(美國公共衛(wèi)生協(xié)會),

USEPA,AOAC,USNCIMS,UKDWI,IBWA,WHO……

假陽性比較：

vs濾膜法假陽性比較：vs濾膜法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997報告者：英國泰晤士水務樣品來源：泰晤士河，樣品數(shù)450個假陽性比較vs濾膜法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997

產生的原因傳統(tǒng)方法培養(yǎng)基非選擇性,會產生相似結果引起假陽性反應培養(yǎng)基污染樣品交叉污染操作誤差

結論試驗證明可以用Colilert取代濾膜法進行大腸菌群和大腸埃希氏菌，還證明了Colilert—DST酶底物法是不受化學、外力等外界因素變化而變化的。假陰性比較：

vs濾膜法及多管法*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997假陰性率產生的原因由于是非特異培養(yǎng)基所以會有雜菌干擾清潔劑、鹽、抗生素、毒素、溫度等原因會造成抑制反應非發(fā)酵大腸菌膜過濾法的問題–過濾膜的損壞m-endoMF*MTF*MLSBMF**Colilert**0%5%10%15%20%25%30%35%40%*Jacobsetal,AEM,1986.**Frickeretal,WaterRes.,1997實驗步驟：97孔定量盤法vs多管發(fā)酵測試時間比較表定性檢測操作示范

－2步法加入科立得試劑，搖晃至溶解

36C培養(yǎng)24小時，判斷結果:1,無顏色變化－陰性2,黃色－總大腸菌群陽性3，黃色且熒光－大腸埃希氏菌陽性44.5℃培養(yǎng)24小時,判斷結果：1、無顏色變化－陰性2、黃色－糞大腸菌群陽性定量檢測（51孔定量盤）－5步法加入科立得試劑后，搖晃至溶解

將Colilert溶液倒入51孔（或97孔）定量盤Quanti-Tray?內固定底物技術酶底物法科立得－所需試劑及設備定性

科立得試劑取樣瓶（可用玻璃瓶替代）定量

科立得試劑取樣瓶（可用玻璃瓶替代）51孔/97孔定量盤程控定量封口機Colilert使用總結科立得市場占有率美國的市場占有率為95%歐洲的市場占有率為90%全國有20余家環(huán)境監(jiān)測站（如北京、上海、四川、廈門、鄭州、沈陽等）、40余家自來水公司、35家省市級疾病預防控制中心及水文站案例分析2004年非典—愛德士捐贈科立得試劑給中國疾病預防控制中心及上海中國疾病預防控制中心抗拒非典案例分析

2008年汶川地震—愛德士公司捐贈1000套科立得試劑到四川省CDC及環(huán)境監(jiān)測站—第一家捐贈試劑到災區(qū)的廠家案例分析

2008年奧運會—協(xié)助北京自來水及北京CDC完成奧運安全供水任務

多管發(fā)酵法與科立得