DC-CTL免疫細(xì)胞對4種惡性腫瘤治療療效觀察蔡學(xué)敏;朱向情;沈麗蓉趙晶;何潔;龐榮清;潘興華【摘要】目的初步觀察自體DC-CTL免疫細(xì)胞回輸對4種惡性腫瘤治療的臨床療效.方法50例腫瘤患者分為4組，乳腺癌組12例,肺癌組27例，結(jié)直腸癌組8例，卵巢癌組3例.分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),分別誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)、樹突狀細(xì)胞(DC),誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)足夠數(shù)量后回輸給患者.分別在治療前后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者外周血淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和腫瘤標(biāo)志物的變化，采用主觀問卷調(diào)查對卡氏行為能力(KPS)進(jìn)行評分，并對治療療效進(jìn)行評價(jià).結(jié)果治療1個(gè)月后，總有效率達(dá)82.0%,且未見明顯副作用.治療后1w,各組外周血CD3、CD4、CD8均顯著升高(Pv0.05),而CD4+/CD8+無顯著變化；各組外周血NK、CIK和KPS評分均顯著升高(P<0.05),而CEA、FRP、CA19,CA153均較治療前明顯下降(P<0.05).結(jié)論自體免疫細(xì)胞治療對改善惡性腫瘤患者生活質(zhì)量，提高患者的免疫功能有明顯作用，且安全性好，為惡性腫瘤的治療提供了一個(gè)新的方向.【期刊名稱】《西南國防醫(yī)藥》【年(卷)，期】2016(026)012【總頁數(shù)】4頁(P1371-1374)【關(guān)鍵詞】樹突狀細(xì)胞;細(xì)胞毒T細(xì)胞;免疫細(xì)胞治療;療效【作者】蔡學(xué)敏;朱向情;沈麗蓉趙晶;何潔;龐榮清;潘興華【作者單位】650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室,昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室,昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;650032昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心，干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明市干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室【正文語種】中文【中圖分類】R318.1免疫細(xì)胞治療是一種獨(dú)特的生物治療技術(shù)，可以利用免疫系統(tǒng)中功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞樹突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)，攝取抗原后，刺激CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞活化，增加殺傷活性［1］。我科從2013年獲原總后衛(wèi)生部批準(zhǔn)開展免疫細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)和臨床應(yīng)用，本研究采用自體DC-CTL免疫細(xì)胞回輸?shù)姆椒?，?0例惡性腫瘤患者進(jìn)行細(xì)胞治療，對前期治療效果進(jìn)行初步總結(jié)。1.1病例資料選擇本院住院腫瘤患者50例，男18例，女32例，年齡32~77歲。按照患者的腫瘤診斷分為4組，其中乳腺癌組12例，肺癌組27例，結(jié)直腸癌組8例，卵巢癌組3例。多為臨床上H、B期分期患者，均接受過化療，其中乳腺癌組8例做過手術(shù)，肺癌組11例做過手術(shù)，結(jié)直腸癌組4例做過手術(shù)，卵巢癌組1例做過手術(shù)。在接受本治療前20d，終止任何放療或化療，并測定外周血T細(xì)胞亞群（CD3、CD4、CD8），檢測相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)行影像學(xué)、血常規(guī)等檢查。1.2治療方案參照原總后衛(wèi)生部〃軍隊(duì)醫(yī)院第三類醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法”開展自體免疫細(xì)胞治療，每例治療3個(gè)療程，每療程回輸DC細(xì)胞數(shù)為（1~5）X106個(gè)細(xì)胞，接連2d;每次回輸細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）數(shù)21x109，每療程回輸細(xì)胞總數(shù)＞5x109。1.3免疫細(xì)胞制備方法［2］無菌采集患者外周血80-100ml，檸檬酸抗凝30min。用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度為2x109個(gè)/L,加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。37匚5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后棄上清，以37°C預(yù)溫的培養(yǎng)液RPMI-1640輕洗去除非貼壁細(xì)胞，非貼壁細(xì)胞倒入另一培養(yǎng)瓶，用無血清培養(yǎng)基AIM-V調(diào)整細(xì)胞密度為1x109個(gè)/L,進(jìn)行CTL細(xì)胞的誘導(dǎo)。同時(shí)用無菌細(xì)胞刮刮取貼壁的黏附細(xì)胞，再以無血清培養(yǎng)基AIM-V調(diào)整細(xì)胞密度為1乂109個(gè)兒1.3.1DC細(xì)胞的體外誘導(dǎo)（1）向黏附細(xì)胞懸液中加入rhGM-CSF和rhIL-4,細(xì)胞因子的應(yīng)用濃度均為50口9兒，進(jìn)行DC誘導(dǎo)培養(yǎng)：隔天進(jìn)行半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子，培養(yǎng)5d后加入TNF-a，濃度均為50凹/L,繼續(xù)培養(yǎng)2d°（2）在誘導(dǎo)DC的過程中，每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。（3）7d后收集懸浮的細(xì)胞，用無菌生理鹽水洗滌3次，1500r/min離心10min，去掉上清，細(xì)胞懸于20ml生理鹽水中，顯微鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于107。檢查無菌、無其他污染后，對患者進(jìn)行細(xì)胞回輸治療，同時(shí)可分析DC的表型及功能。1.3.2CTL細(xì)胞的誘導(dǎo)(1)向未貼壁細(xì)胞懸液中加入INF-y，細(xì)胞因子的應(yīng)用濃度為2000U/ml,培養(yǎng)24h°(2)加入rhIL-2濃度為2000U/ml,PHA濃度為40pg/ml,CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml,隔天進(jìn)行半量換液，補(bǔ)充細(xì)胞因子，培養(yǎng)到第8do(3)收集細(xì)胞，用無菌生理鹽水洗滌3次，1500r/min離心10min，去掉上清，細(xì)胞懸于20ml生理鹽水中，顯微鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于109。檢查無菌、無其他污染后，對患者進(jìn)行細(xì)胞回輸治療。1.4觀察指標(biāo)分別在治療前和治療后1w,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者外周血CD3+、CD4+、CD8+水平和腫瘤標(biāo)志物，并采用主觀問卷調(diào)查對卡氏行為能力(KPS)進(jìn)行評分。1.5療效評定治療結(jié)束后1個(gè)月，參照WHO實(shí)體腫瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)：完全緩解(CR):所有可見病變完全消失并至少維持4w；部分緩解(PR):腫瘤基線病灶長徑總和縮小30%;穩(wěn)定(SD):腫瘤基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR，或有增加但未達(dá)PD;進(jìn)展(PD):腫瘤基線病灶長徑總和增加20%或出現(xiàn)新病灶。有效率=[(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總例數(shù)]x100%。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料組間比較采用配對t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.1臨床治療效果治療總有效率達(dá)82.0%(表1),觀察期間未見明顯毒副作用，僅2例輸入細(xì)胞后出現(xiàn)低熱，體溫38°C,2h后自行緩解。2.2治療前后各組相關(guān)檢測指標(biāo)的變化治療后1w,各組外周血CD3+、CD4+、CD8+均顯著升高(P<0.05)，而CD4+/CD8+無顯著變化(P>0.05)，見表2。治療后1w,各治療組外周血NK、CIK和KPS評分均顯著升高(P<0.05，表3）。治療后1w,各組CEA、FRP、CA19,CA153均較治療前明顯下降（P<0.05,表4）。腫瘤已經(jīng)是威脅我國人民生命的主要疾病，全國每年新增腫瘤患者約220萬，每年約有180萬人死于腫瘤，占總死亡人數(shù)的1/5，占總死因的第2位，在城市占第1位［3］。DC-CTL細(xì)胞過繼免疫治療就是通過抽取、分離患者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，在體外添加特異組合的細(xì)胞因子及單克隆抗體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲取大量有抗腫瘤活性DC和CIK細(xì)胞，并可分泌多種有抗腫瘤活性細(xì)胞因子，回輸?shù)襟w內(nèi)后達(dá)到直接殺傷體內(nèi)殘余腫瘤細(xì)胞，預(yù)防復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及提高患者機(jī)體免疫功能，并可產(chǎn)生免疫記憶保護(hù)，達(dá)到更長久的抗腫瘤效果［4］。DC-CTL細(xì)胞治療腫瘤安全有效，特別是對于手術(shù)后的腫瘤患者，對清除殘留微小的轉(zhuǎn)移病灶、防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散和復(fù)發(fā)、提高患者自身免疫力等具有重要作用。對于已擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、無法承受手術(shù)、放療、化療的嚴(yán)重腫瘤患者，也可單獨(dú)使用免疫療法或聯(lián)合使用免疫療法，可以大大提高患者的承受能力及提高化療、放療的療效，降低放療、化療的毒副作用，減輕痛苦，提高患者的生存質(zhì)量［5］。本研究對本院住院50例惡性腫瘤患者進(jìn)行免疫細(xì)胞治療，治療后，患者的KPS評分有顯著提高，患者生活質(zhì)量均有改善，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)。淋巴細(xì)胞免疫功能分析，CD4+、CD8+細(xì)胞比例和數(shù)量增加，免疫功能明顯改善。從目前的療效來看，手術(shù)、放療、化療后的患者，腫瘤負(fù)荷較小，相對效果更好。對于腫瘤IV期的患者，由于腫瘤負(fù)荷較大，自身免疫功能低下，細(xì)胞活性不高，相對治療效果較差，但對生活質(zhì)量的提高及延長生命有一定作用。因此，免疫細(xì)胞治療應(yīng)該積極配合其他傳統(tǒng)治療，對腫瘤采取綜合治療的手段，療效更佳［6］。另外免疫細(xì)胞治療相對安全，無毒副作用，僅2例輸入細(xì)胞后出現(xiàn)低熱（38。0,2h后自行緩解。但目前DC-CTL細(xì)胞治療也面臨著一些問題，例如如何提高DC細(xì)胞抗原靶向性；腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制復(fù)雜，有時(shí)DC細(xì)胞難以捕獲有效抗原;此外DC細(xì)胞的誘導(dǎo)效率低，也是免疫細(xì)胞治療的瓶頸問題?，F(xiàn)在有許多直接轉(zhuǎn)入相關(guān)的腫瘤抗原基因到DC的方法進(jìn)行嘗試，也有在DC細(xì)胞中轉(zhuǎn)入IL-12的基因[7]，加強(qiáng)抗原提呈的效果，也取得了一定的成效，但仍需進(jìn)一步的深入研究?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】KawakamiY.Cancertreatmentbycomprehensiveregulationofanti-tumorimmunenetwork[J].NipponRinsho,2010,68(6):1094-1099.蔡學(xué)敏，朱向情，劉凌，等.人外周血樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)、鑒定及活性測定[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志(電子版),2012，2(4):231-236.陳萬青，鄭榮壽，曾紅梅，等.2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2015,24(1):1-10.WangX,YuW,LiH,etal.Canthedual-functionalcapabilityofCIKcellsbeusedtoimproveantitumoreffects[J]?CellImmunol,2014,287:18-22.PanK，WangQJ，LiuQ，etal.Thephenotypeofexvivogeneratedcytokine-inducedkillercellsisassociatedwithoverallsurvivalinpatientswithcancer[J].TumourBiol,2014,35(1):701-707.ChenhongZheng,GanjunYu,HuiWang,etal.Meta-analysisofchemotherapyanddendriticcellswithcytokine-inducedkillercellsinthetreatmentofnon-small-celllungcancer[J].