建立拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)血清的方法用于胃癌診斷的研究胃癌指源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，常見(jiàn)為胃腺癌。胃癌發(fā)病隱匿，早期無(wú)明顯癥狀，晚期癥狀明顯，發(fā)病率隨年齡的增加而顯著增高，發(fā)病高峰年齡在50~80歲，男性的發(fā)病率是女性的1.5~2.5倍［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)胃癌發(fā)病率和死亡率均位于惡性腫瘤的第二位。目前，胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)胃鏡檢查及病理活檢找到癌細(xì)胞而確診［2］，但仍存在著局限性，其對(duì)設(shè)備和操作醫(yī)生技術(shù)要求高，經(jīng)濟(jì)花銷大，取材范圍局限，屬于有創(chuàng)操作，且易使患者產(chǎn)生不適等。因此，開展快速、便捷、無(wú)創(chuàng)、精準(zhǔn)的胃癌篩查技術(shù)，對(duì)胃癌的早期預(yù)警與快速診斷至關(guān)重要。拉曼光譜（Ramanspectra）由印度科學(xué)家拉曼（Raman）發(fā)現(xiàn)，是一種入射光照射到物質(zhì)上產(chǎn)生的與入射光頻率不同的散射光譜，對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息，可應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)的研究，也可用于分析生物樣本所含物質(zhì)種類和含量的差異［3,

4］，即通過(guò)探測(cè)分子中特定鍵的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)，來(lái)獲得相應(yīng)分子組成結(jié)構(gòu)和分子間相互作用的信息。由于每個(gè)生物樣品具有獨(dú)特的組成，其組成成分蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和碳水化合物的活性官能團(tuán)產(chǎn)生的拉曼光譜分布是不同的，因此拉曼光譜可以作為化合物和混合物的“指紋圖譜”［5,

6,

7］。拉曼光譜技術(shù)已在不同類型生物樣本的檢測(cè)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力［8,

9,

10］，其中最常用的為表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhancedramanspectroscopy，SERS）技術(shù)，過(guò)去十年間，已有大量研究嘗試?yán)肧ERS檢測(cè)技術(shù)對(duì)腫瘤診斷進(jìn)行探索性研究。拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)胃癌患者的血清標(biāo)本時(shí)，所需標(biāo)本量少、僅幾微升，標(biāo)本獲取容易，對(duì)患者創(chuàng)傷小，便捷易行；拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)耗時(shí)短，每測(cè)一位患者一條全波譜范圍內(nèi)的拉曼光譜僅需1min，可行性強(qiáng)，可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)；拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)時(shí)水干擾性小、對(duì)檢測(cè)血清標(biāo)本不需要進(jìn)行標(biāo)記，不需要檢測(cè)試劑盒，不需要臨床上機(jī)，經(jīng)濟(jì)便捷。本研究采用無(wú)標(biāo)記、無(wú)增強(qiáng)的拉曼光譜技術(shù)，結(jié)合多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件構(gòu)建判別模型，對(duì)健康人和胃癌患者拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探索使用多元統(tǒng)計(jì)分析模型是否能將兩類人群區(qū)分開來(lái)，并使用結(jié)直腸癌患者血清標(biāo)本來(lái)驗(yàn)證模型的可靠性。本研究建立了一種拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)胃癌患者血清的方法用于胃癌的診斷，為胃癌的輔助診斷提供新方法。對(duì)象與方法一、對(duì)象收集2019年4月至10月在陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為胃癌的患者110例（110例胃癌患者中71例做了臨床病理分期，Ⅰ期占24例，Ⅱ期占17例，Ⅲ期占21例，Ⅳ期占9例），其中男73例，女37例，年齡為（57.4±10.3）歲；收集確診為結(jié)直腸癌的患者74例，其中男48例，女26例，年齡為（58.3±12.2）歲；健康對(duì)照組為收集同期健康體檢者100名，其中男59名，女41名，年齡為（55.6±10.61）歲；健康對(duì)照組、胃癌組、結(jié)直腸癌組年齡和性別構(gòu)成比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。樣本納入及排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）胃癌組：臨床確診為胃癌的患者，患者來(lái)院之前未行過(guò)任何放化療及藥物治療等，患者病歷診斷中無(wú)其他惡性腫瘤病史；（2）結(jié)直腸癌組：臨床確診為結(jié)直腸癌的患者，患者來(lái)院之前未行過(guò)任何放化療及藥物治療等，患者病歷診斷中無(wú)其他惡性腫瘤病史；（3）健康對(duì)照組：為健康體檢者，胃腸道功能均正常，無(wú)任何消化系統(tǒng)疾病；無(wú)心、肝、脾、肺、腎等器官功能不良，無(wú)惡性腫瘤病史。本研究方案與使用樣本已獲得陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)［KY20200318］。二、儀器與設(shè)備本實(shí)驗(yàn)采用法國(guó)HORIBA公司的XploRAPLUS型拉曼光譜儀，其內(nèi)置3個(gè)激光器（532、633、785nm），4塊光柵，以及可供選擇的多光譜分辨率，系統(tǒng)探測(cè)器平臺(tái)能自動(dòng)切換，可在全光譜范圍（100~4000cm-1）進(jìn)行拉曼光譜采集。拉曼系統(tǒng)的工作原理為：激光器發(fā)出偏振光，透過(guò)濾光片照在樣本上，樣本上發(fā)出的散射光經(jīng)透鏡聚焦到單色器，獲得的單色光在光電管聚焦，再由放大器放大處理，從而獲得樣品的拉曼光譜圖。三、樣品采集分別對(duì)100名健康對(duì)照組、110例術(shù)前胃癌組、74例術(shù)前結(jié)直腸癌組患者進(jìn)行空腹靜脈血采樣，每例各采血5ml于無(wú)抗凝劑采血管中，以3000×g的轉(zhuǎn)速上機(jī)離心5min，獲得上清液血清。每份樣本取血清500μl于1.5ml凍存管中。將獲得的血清樣本儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中待測(cè)。進(jìn)行血清樣本拉曼光譜檢測(cè)時(shí)，將血清樣本從冰箱中取出，室溫下解凍，每例樣本取樣5μl點(diǎn)至玻片上，室溫下干燥30min后上機(jī)進(jìn)行拉曼光譜采集。四、樣本檢測(cè)測(cè)量開始前，先使用單晶硅片對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，在532nm激光器下，采集200~2000cm-1范圍內(nèi)硅片的拉曼光譜，光譜在520cm-1處有可見(jiàn)的振動(dòng)峰則代表儀器校準(zhǔn)通過(guò)。隨后進(jìn)行血清樣本拉曼光譜采集，采用的拉曼系統(tǒng)HORIBAxploRAPLUS的功率為55mV，在激光波長(zhǎng)532nm、激光功率100%、采集時(shí)長(zhǎng)60s、光譜范圍200~2000cm-1等條件下，逐一檢測(cè)健康血清100例，胃癌血清110例，結(jié)直腸癌血清74例，每份血清樣本采集不同位置的4條拉曼光譜，獲得健康血清原始拉曼光譜400條，胃癌血清原始拉曼光譜440條，結(jié)直腸癌血清原始拉曼光譜296條，實(shí)驗(yàn)在暗室環(huán)境下由同一人操作完成。五、光譜處理使用拉曼系統(tǒng)配套軟件LabSpec6對(duì)采集的原始拉曼光譜進(jìn)行平滑降噪、基線校正，并對(duì)每條光譜進(jìn)行歸一化處理（在200~2000cm-1范圍內(nèi)），將拉曼光譜轉(zhuǎn)換成光譜數(shù)據(jù)，獲得健康樣本光譜數(shù)據(jù)400條和胃癌樣本光譜數(shù)據(jù)440條，結(jié)直腸癌樣本光譜數(shù)據(jù)296條，分別對(duì)每例健康、胃癌、結(jié)直腸癌樣本對(duì)應(yīng)的4條光譜數(shù)據(jù)求平均，于是獲得健康組光譜數(shù)據(jù)100條和胃癌組光譜數(shù)據(jù)110條，結(jié)直腸癌組光譜數(shù)據(jù)74條。胃癌Ⅰ期24例，Ⅱ期17例，Ⅲ期21例，Ⅳ期9例患者的血清樣本，每份采集了不同位置的4條拉曼光譜，并分別進(jìn)行平滑降噪、基線校正，對(duì)每條光譜進(jìn)行歸一化處理獲得可在同一基準(zhǔn)水平上進(jìn)行比較的胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血清樣本拉曼光譜96、68、84和36條，轉(zhuǎn)換成光譜數(shù)據(jù)，并對(duì)每例胃癌樣本對(duì)應(yīng)的4條光譜數(shù)據(jù)分別求平均，獲得胃癌Ⅰ期光譜數(shù)據(jù)24條，Ⅱ期光譜數(shù)據(jù)17條，Ⅲ期光譜數(shù)據(jù)21條，Ⅳ期9條。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析主成分分析（PrincipalComponentAnalysis，PCA）是多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中最重要的降維方法之一，被廣泛應(yīng)用到光譜數(shù)據(jù)的定性分析；正交偏最小二乘判別分析法（orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis，OPLS-DA）能夠?qū)⒂欣跇颖痉诸惖淖兞啃畔⒏行У靥崛〕鰜?lái)，用于分析2組樣本間的差異。PCA和OPLS-DA分析方法都采用相關(guān)系數(shù)：模型對(duì)X矩陣的累計(jì)解釋率（R2X）、模型對(duì)Y矩陣的累計(jì)解釋率（R2Y）和預(yù)測(cè)系數(shù)（Q2）來(lái)評(píng)估分析模型的質(zhì)量，R2表示模型的擬合力，Q2表示模型的預(yù)測(cè)性［11］，理論上R2和Q2的值越接近1說(shuō)明模型的擬合力和預(yù)測(cè)性越好，反之越差。為了探索和分析健康人血清與胃癌患者血清之間的差異，使用多元變量統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA14.1中的PCA與OPLS-DA方法構(gòu)建判別模型，對(duì)健康組（100條光譜數(shù)據(jù)）與胃癌組（110條光譜數(shù)據(jù)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為了驗(yàn)證模型的可靠性，使用結(jié)直腸癌患者血清標(biāo)本74例對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，同樣使用OPLS-DA方法構(gòu)建判別模型，對(duì)健康組（100條光譜數(shù)據(jù)），胃癌組（110條光譜數(shù)據(jù)）和結(jié)直腸癌組（74條光譜數(shù)據(jù)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果一、光譜分析結(jié)果對(duì)100條健康樣本拉曼光譜與110條胃癌樣本拉曼光譜分別求平均，獲得健康血清拉曼光譜（平均值）和胃癌血清拉曼光譜（平均值）如圖1所示，圖1中健康組與胃癌組拉曼光譜均可檢測(cè)到重復(fù)性較好的6個(gè)峰，分別位于1001.17、1154.63、1337.89、1446.85、1515.33、1658.34cm-1位移處，在這6個(gè)拉曼峰處，健康組拉曼強(qiáng)度依次為：0.250、0.670、0.116、0.167、0.670、0.211counts，胃癌組拉曼強(qiáng)度依次為：0.230、0.440、0.136、0.210、0.423、0.266counts，兩組在這6個(gè)峰處的拉曼強(qiáng)度差異明顯。在1001.17、1154.63、1515.33cm-1位移處，健康組拉曼強(qiáng)度高于胃癌組；在1337.89、1446.85、1658.34cm-1位移處，胃癌組拉曼強(qiáng)度高于健康組。圖1

健康和胃癌血清拉曼光譜圖（平均值）查閱文獻(xiàn)對(duì)特征峰1001.17、1154.63、1337.89、1446.85、1515.33、1658.34cm-1進(jìn)行峰位歸屬［12,

13,

14］，結(jié)果見(jiàn)表1拉曼光譜峰位歸屬表。對(duì)胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血清樣本拉曼光譜24、17、21、9條分別求平均值。獲得胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血清拉曼光譜（平均值）如圖2所示，圖2中胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期拉曼光譜中可檢測(cè)到重復(fù)性較好的個(gè)6峰，分別位于1001.85、1155.07、1338.36、1445.75、1515.92、1657.68cm-1位移處。在1155.07、1515.92cm-1位移處，胃癌Ⅳ期拉曼強(qiáng)度高于胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。圖2

胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血清拉曼光譜圖（平均值）二、多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果采用多變量統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA14.1中的PCA方法對(duì)健康組（100條光譜數(shù)據(jù)）與胃癌組（110條光譜數(shù)據(jù)）進(jìn)行分析，PCA無(wú)需對(duì)2組光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，可直接提取2組光譜數(shù)據(jù)的特征進(jìn)行無(wú)監(jiān)督建模分析，基于PCA方法建立健康組和胃癌組血清樣本分類模型，結(jié)果顯示第一主成分PC1=0.362，第二主成分PC2=0.153，PC1和PC2可描述的方差和占總體的51.5%，且獲得的PCA散點(diǎn)圖中健康組與胃癌組間存在著較多的交叉點(diǎn)，說(shuō)明模型區(qū)分能力較差，因此需進(jìn)一步使用OPLS-DA方法進(jìn)行分析。分析結(jié)果如OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖，圖中每個(gè)點(diǎn)代表1例樣本，綠色點(diǎn)代表100份健康人血清樣本，藍(lán)色點(diǎn)代表110例胃癌患者血清樣本，橢圓表示95%的置信區(qū)間。OPLS-DA模型散點(diǎn)圖中R2X（cum）=0.809，R2Y（cum）=0.819，Q2（cum）=0.758（圖3），健康組和胃癌組血清樣本之間有明顯的組間分離和組內(nèi)聚集趨勢(shì)。圖3

OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖為了評(píng)估模型的準(zhǔn)確性，進(jìn)行OPLS-DA模型驗(yàn)證置換檢驗(yàn)（圖4），圖中橫坐標(biāo)為與原模型的相似度，縱坐標(biāo)為R2Y及Q2值，一般進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)。圖中最右邊2個(gè)定點(diǎn)為OPLS-DA模型的R2Y和Q2，其坐標(biāo)為R2Y（0.819，1）及Q2（0.758，1）；所有左邊綠點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)分別為模擬的R2Y及Q2，其與Y軸的截距坐標(biāo)為R2Y（0，0.231）及Q2（0，-0.353）。所有左邊藍(lán)色的Q2點(diǎn)要比右邊OPLS-DA模型Q2點(diǎn)低，所有左邊綠色的R2Y點(diǎn)要比右邊OPLS-DA模型R2Y點(diǎn)低，且Q2的回歸直線與Y軸相交于零點(diǎn)以下，說(shuō)明模型不存在過(guò)度擬合且模型可靠。圖4

OPLS-DA模型驗(yàn)證置換檢驗(yàn)圖為了對(duì)構(gòu)建模型OPLS-DA的性能進(jìn)行評(píng)估，胃癌組ROC曲線AUC值為0.998（圖5）。圖5

OPLS-DA診斷胃癌的ROC曲線進(jìn)一步探索胃癌各分期之間的差異，采用PCA和OPLS-DA方法對(duì)胃癌Ⅰ期24條，Ⅱ期17條，Ⅲ期21條，Ⅳ期9條光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCA或OPLS-DA方法均不能對(duì)胃癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各期血清樣本做有效區(qū)分。為了驗(yàn)證健康組與胃癌組OPLS-DA的可靠性，構(gòu)建了OPLS-DA模型對(duì)健康組（100條光譜數(shù)據(jù)），胃癌組（110條光譜數(shù)據(jù)）和結(jié)直腸癌組（74條光譜數(shù)據(jù)）進(jìn)行分析，OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖（圖6）顯示，R2X（cum）=0.875，R2Y（cum）=0.873，Q2（cum）=0.820，可見(jiàn)模型的擬合力和預(yù)測(cè)性均良好，健康組、胃癌組和結(jié)直腸癌組血清樣本之間有明顯的組間分離和組內(nèi)聚集趨勢(shì)，模型可靠。圖6

OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖（圖中綠色點(diǎn)代表100例健康人血清樣本，藍(lán)色點(diǎn)代表110例胃癌患者血清樣本，紅色點(diǎn)代表74例結(jié)直腸癌患者血清樣本，橢圓表示95%的置信區(qū)間）對(duì)構(gòu)建的健康組-胃癌組-結(jié)直腸癌組OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)，OPLS-DA模型驗(yàn)證置換檢驗(yàn)（圖7）顯示，最右邊2個(gè)定點(diǎn)為健康組-胃癌組-結(jié)直腸癌組OPLS-DA模型的R2Y和Q2，其坐標(biāo)為R2Y（0.873，1）及Q2（0.820，1）；左邊的點(diǎn)為模擬的R2Y及Q2，其與Y軸的截距坐標(biāo)為R2Y（0，0.177）及Q2（0，-0.288）。所有左邊藍(lán)色的Q2點(diǎn)要比右邊OPLS-DA模型Q2點(diǎn)低，所有左邊綠色的R2Y點(diǎn)要比右邊OPLS-DA模型R2Y點(diǎn)低，且Q2的回歸直線與Y軸相交于零點(diǎn)以下，模型不存在過(guò)度擬合。圖7

OPLS-DA模型驗(yàn)證置換檢驗(yàn)圖討論近年來(lái)，拉曼光譜技術(shù)因?qū)崟r(shí)、非侵入、快速等優(yōu)點(diǎn)，已作為一種分析工具被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域，展現(xiàn)出巨大的潛力。為了進(jìn)一步增強(qiáng)拉曼光譜的信號(hào)強(qiáng)度，研究者開發(fā)了許多增強(qiáng)拉曼信號(hào)的新技術(shù)，用于細(xì)菌及蛋白質(zhì)等的鑒別和分析，如SERS、紫外共振拉曼光譜法、空間位移拉曼光譜法、受激拉曼光譜法以及針尖拉曼光譜法等，但應(yīng)用最廣的還屬SERS。拉曼光譜技術(shù)在細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用研究較多。St?ckel等［15］通過(guò)主成分分析和群分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法［16］對(duì)26種分枝桿菌及其耐藥性的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，顯微拉曼光譜的準(zhǔn)確性高達(dá)94%，表明顯微拉曼光譜可作為臨床快速診斷的理想工具。李巖等［17］采用拉曼光譜分析方法，對(duì)血液透析液中的酵母菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定，從288份樣品中檢測(cè)出146種酵母菌，表明拉曼光譜技術(shù)可能成為臨床診斷真菌感染的有效技術(shù)手段。黃杰倫等［18］最新研究將拉曼光譜技術(shù)與深度學(xué)習(xí)相結(jié)合，提出一種基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的新型冠狀病毒拉曼光譜分類方法，有望成為一種新型的新型冠狀病毒檢測(cè)方法。拉曼光譜技術(shù)也廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域中體液標(biāo)本的檢測(cè)，例如尿液、血液、腦脊液、唾液樣本的檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)利用SERS技術(shù)檢測(cè)尿液可對(duì)腎臟功能進(jìn)行評(píng)估，但僅能實(shí)現(xiàn)相關(guān)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)限分析，而定量或半定量檢測(cè)仍存在一定的局限性。此外，針對(duì)于尿液成分的分析，目前拉曼技術(shù)已能達(dá)到臨床標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)限［19］。拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)血液樣本中球蛋白、白蛋白和膽固醇等主要生物標(biāo)志物，可實(shí)現(xiàn)哮喘、卵巢癌等疾病的判別，例如Sahu等［20］使用拉曼光譜技術(shù)對(duì)44例哮喘患者和15名健康人的血液成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果哮喘患者和健康人的拉曼光譜結(jié)果存在顯著差異；Paraskevaidi等［21］利用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)檢測(cè)卵巢癌患者血漿中的癌癥標(biāo)志物CA-125，其敏感度達(dá)到了80%。本研究拉曼光譜技術(shù)用于胃癌的檢