人胰液雙向凝膠電泳分離技術(shù)建立及優(yōu)化摘要：目的建立并優(yōu)化人胰液蛋白質(zhì)組的雙向凝膠電泳分離方法。方法通過比較幾種常用的體液處理方法，確定了一種適于人胰液的蛋白質(zhì)樣品處理方法。經(jīng)過一維等電聚焦和二維SDS電泳后，有效分離了人胰液蛋白質(zhì)組。結(jié)果通過優(yōu)化胰液蛋白質(zhì)提取、上樣量和固相IPG膠條分離范圍的選擇等步驟，建立了人胰液雙向凝膠電泳的方法，并獲得了分辨率較高、重復性較好的雙向凝膠電泳圖譜。結(jié)論丙酮沉淀與雙向凝膠電泳技術(shù)的結(jié)合是研究人胰液蛋白質(zhì)組的一種有效的方法。胰液雙向凝膠電泳方法的優(yōu)化可為今后開展疾病相關(guān)的胰液蛋白質(zhì)組學研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學；人胰液；雙向凝膠電泳中圖分類號：O655.4文獻標識碼：A文章編號：1672-979X(2007)04-0005-05EstablishmentandOptimizationofSeparationofHumanPancreaticJuicebyTwo-DimensionalGelElectrophoresisLIUXiao-yong,HANJin-xiang,CUIYa-zhou,ZONGMei-juan,CHENYu,TIANMei(ShandongMedicalBiotechnologicalCenter,KeyLaboratoryforBiotech-Drugs,MinistryofHealth,Jinan250062,China)Abstract:ObjectiveToestablishandoptimizethetwo-dimensionalgelelectrophoresisseparationofproteomeinhumanpancreaticjuice.MethodsBycomparingseveralcommonlyusedproteinextractionmethods,amethodfortheseparationofproteomeinhumanpancreaticjuicewasdetermined.TheproteomeinhumanpancreaticjuicewaseffectivelyconcentratedandseparatedbyisoelectricfocusingonfirstdimensionandSDSonseconddimension.ResultsByoptimizingtheextractionofproteinsinhumanpancreaticjuice,loadingamountandseparationscopeofIPGstrip,theproteinsweresuccessfullyextractedfromhumanpancreaticjuiceandwereseparatedbytwo-dimensionalgelelectrophoresiswithhigherresolutionandbetterreproducibility.ConclusionAcetone-precipitationcombinedwithtwo-dimensionalgelelectrophoresisisasuitableapproachtostudytheproteomeinhumanpancreaticjuice.Theoptimizationoftheseparationofhumanpancreaticjuicebytwo-dimensionalgelelectrophoresislaysatechnologicalfoundationforthefurtherinvestigationofdisease-relatedhumanpancreaticjuiceproteomics.Keywords:proteomics;humanpancreaticjuice;two-dimensionalgelelectrophoresis胰液中含有胰腺組織細胞所釋放的高濃度的蛋白質(zhì)與DNA。胰液中蛋白質(zhì)的變化與胰腺的生理或病理狀態(tài)密切相關(guān)，這些蛋白質(zhì)是潛在的胰腺疾病標記物。因此，胰液的檢測對早期胰腺疾病的篩查具有重要意義。目前國際上對胰液蛋白組分的研究多采用表面增強激光解析飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)［1］和一維液相分離與質(zhì)譜鑒定聯(lián)用(1DLC-MS/MS)的方法［2］，發(fā)現(xiàn)了HIP/PAP-I、PAP-2等具有重要的臨床應用價值的胰腺腫瘤檢測標志物。然而這兩種方法的定量偏差和分辨率不高的缺陷卻成為深入研究胰液蛋白質(zhì)組學的技術(shù)瓶頸。雙向凝膠電泳技術(shù)依據(jù)蛋白質(zhì)等電點進行第一向等電聚焦，然后根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進行第二向SDS分離，可以在一個平面上分離出數(shù)以千計的蛋白質(zhì)，在整體水平上研究生命活動的規(guī)律，從中篩選出潛在的生物標記物，為尋找胰腺疾病早期診斷、治療、預后的特異性標志物提供新的途徑。但是胰液樣品中富含的鹽、脂和蛋白酶等物質(zhì)，對雙向凝膠電泳干擾較大。因此，如何提高胰液雙向凝膠電泳的分辨率和重復性成為胰液蛋白質(zhì)組研究的首要問題。本研究通過對胰液樣品雙向凝膠電泳的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分析，建立了一種適合于有效分離胰液蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳技術(shù)方案，得到了分辨率較高和重復性較好的電泳圖譜。1材料和方法1.1材料1.1.1標本胰液標本由山東大學齊魯醫(yī)院通過術(shù)后引流的方法提供。1.1.2主要試劑考馬斯亮藍R350，IPGbuffer（immobilizedpHgradientbuffer），ImmobilizedDryStrip，礦物油，2D-Quant試劑盒，2D-Cleanup試劑盒（GEAmersham公司）；尿素，硫脲，CHAPS，二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），三羥甲基氨基甲烷（Tris-base），碘乙酰胺（IAA），甘氨酸，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，四甲基二乙胺（TEMED），過硫酸銨，硝酸銀，十二烷基磺酸鈉（SDS），甘油，瓊脂糖等（Ameresco公司）；其余為國產(chǎn)分析純試劑。1.1.3主要儀器與軟件ALC-210精密天平（Sartorius公司）；超聲粉碎儀GY98-3d（寧波新芝研究所）；Microfuge22R高速低溫離心機（Beckman公司）；Vmax酶標儀（MolecularDevice公司）；EttanIPGphorII等電聚焦儀、EttanDALTtwelve垂直電泳儀和ImageMaster5.0凝膠圖像分析軟件（GEAmersham公司）；PowerLook2100XL掃描儀（Umax公司）；4700型質(zhì)譜儀（ABI公司）；SZ-93純水蒸餾裝置（上海雅榮公司）；超低溫冰箱（SANYO公司）；QL-901Vortex和TS-1脫色搖床（其林貝爾公司）等。1.2樣品處理新鮮胰液標本10000Xg,4笆離心20min，收集上清分裝一80笆保存?zhèn)溆?。將標本分別按如下方法處理：2D-Cleanup試劑盒處理胰液標本，操作參照試劑盒說明書。用裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS,65mmol/LDTT，2%IPGBuffer）溶解沉淀過夜。在胰液標本中加入4倍體積的預冷丙酮［含1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）］，—20°C沉淀2h后，4笆，10000Xg離心10min。用預冷的丙酮洗滌沉淀，室溫干燥后，用裂解液溶解沉淀過夜［2］。在胰液標本中加入4倍體積的預冷三氯乙酸（TCA）/丙酮混合液（含20%TCA，80%丙酮，1mmol/LPMSF），—20C沉淀2h后，4C，10000Xg離心10min。用預冷的丙酮洗滌沉淀，室溫干燥后，用裂解液溶解沉淀過夜。使用2D-Quant試劑盒將以上3種方法處理的樣品和未經(jīng)處理的胰液標本蛋白質(zhì)定量。1.3第一向等電聚焦電泳與平衡將樣品與水化液（8mol/LUrea,2%CHAPS,18mmol/LDTT,0.5%IPGBuffer，痕量溴酚藍）混合，分組使用18cm和24cmIPG膠條（pH3~10NL）在IPGphorII水平電泳儀進行等電聚焦電泳。總聚焦數(shù)分別為50kVh和65kVh。等電聚焦電泳后，將膠條從電泳槽中取出，用潤濕的濾紙吸掉膠條上多余的礦物油，分別在平衡液基礎(chǔ)液［1.5mol/LTris-HCl（pH8.8），6mol/L尿素，87%（體積分數(shù)）甘油69mL/200mL，2%（質(zhì)量濃度）SDS］中加入1%DTT，和2.5%IAA2次平衡各12min。1.4第二向SDS電泳將平衡好的膠條放置于12.5%均勻SDS分離膠上端，用0.5%瓊脂糖封固。電泳參數(shù)設(shè)置：初始功率每膠0.2W，電泳1h，然后使用每膠0.4W，電泳1h，再以每膠17W電泳大約6h，待溴酚藍前沿遷移至SDS膠下緣時停止電泳。1.5染色使用考馬斯亮藍R350染色法（方法參見說明書）對凝膠染色。1.6圖像采集與分析PowerLook2100XL掃描凝膠，并使用ImageMaster5.0軟件分析圖像。1.7酶解與質(zhì)譜鑒定將切取的蛋白質(zhì)點酶解后，進行質(zhì)譜鑒定［3］。2實驗結(jié)果2.1胰液蛋白幾種提取法的電泳結(jié)果我們分別使用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和2D-Cleanup試劑盒3種方法對胰液樣品進行了處理。將提取的蛋白質(zhì)定量后，我們按100^g的蛋白質(zhì)量在18cm干膠條（pH3~10NL）上雙向凝膠電泳（圖1）。未經(jīng)處理的胰液原液雙向凝膠電泳圖譜（點數(shù)271）；丙酮沉淀法處理的胰液雙向凝膠電泳圖譜（點數(shù)318）；TCA/丙酮沉淀法處理的胰液雙向凝膠電泳圖譜（點數(shù)274）；D.2D-Cleanup試劑盒法處理的胰液雙向凝膠電泳圖譜（點數(shù)294）。2.2等電聚焦電泳不同上樣量的電泳結(jié)果蛋白質(zhì)的上樣量會直接影響雙向凝膠電泳圖譜的分辨率。圖2是丙酮沉淀法處理的胰液樣品在不同上樣量情況下的雙向凝膠電泳圖譜。A.胰液蛋白質(zhì)500^g上樣量雙向凝膠電泳圖譜（點數(shù)629）；B.胰液蛋白質(zhì)100rg上樣量雙向凝膠電泳圖譜（點數(shù)318）。2.3等電聚焦電泳IPG膠條不同長度的電泳結(jié)果在IPG膠條長度的選擇上，我們按500rg蛋白質(zhì)上樣量分別選取了2種長度的IPG膠條，進行了雙向凝膠電泳（圖3）,圖3A是18cmpH3~10NL的膠條（點數(shù)629），圖3B是24cmpH3~10NL的膠條（點數(shù)634）。此外，諸如等電聚焦的電壓設(shè)置、平衡時間的選擇、SDS電泳的電流設(shè)置，染色方法的選擇等一些其他實驗條件和方法，都是我們經(jīng)過反復比較、優(yōu)化調(diào)整而得出的。2.4部分蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果我們對電泳凝膠的蛋白質(zhì)點酶解后，進行了質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些新的胰液相關(guān)蛋白質(zhì)。見表1。3討論由于胰腺位置隱蔽，多數(shù)胰腺疾病臨床癥狀不典型，同時又缺少敏感和特異性的診斷指標，導致胰腺疾病嚴重威脅人類的健康和生命［3］。因此，發(fā)現(xiàn)新的敏感的、特異性強的胰腺疾病標記物進行早期篩查，成為當前胰腺疾病研究的主要方向。胰液中含有很多胰腺分泌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，在許多生理或病理狀態(tài)下，這些蛋白質(zhì)會在胰液中出現(xiàn)質(zhì)或量的變化。與其他的胰液蛋白質(zhì)分離方法相比較，雙向凝膠電泳具有分辨率高、定量相對準確等優(yōu)勢。然而胰液樣品中的鹽、脂和蛋白酶等對雙向凝膠電泳干擾較大，影響電泳圖譜的重復性。因此，探尋一種能夠有效增加胰液中蛋白質(zhì)的抽提及其溶解性的方法，是建立胰液蛋白質(zhì)表達譜所要解決的首要問題。本文通過對胰液樣品雙向凝膠電泳的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)的分析，建立起一種適合于有效分離胰液蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳技術(shù)方案，并對胰液中的部分蛋白質(zhì)進行了鑒定，得到了一些尚未報道的胰液相關(guān)蛋白質(zhì)。3.1丙酮沉淀法提取胰液蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)沉淀的方法可以去除脂、鹽和核酸等雜質(zhì)對等電聚焦電泳的干擾，還可以抑制蛋白酶活性，減少蛋白質(zhì)降解并在一定程度上富集低濃度蛋白質(zhì)，因此被廣泛用于蛋白質(zhì)樣品的預處理和純化。常用的沉淀劑為丙酮和TCA。由于我們在使用TCA處理其他樣品時有蛋白質(zhì)丟失現(xiàn)象，因此我們將TCA和丙酮按1:4的比例混合作為另一種沉淀劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)沉淀法處理的樣品圖譜與胰液原液的電泳圖譜相比較雖然有少量蛋白點的丟失，但是處理后的胰液電泳圖譜在重復性和分辨率上要優(yōu)于胰液原液圖譜，并且出現(xiàn)了一些新的蛋白點，這些點是一些被脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)，以及一些容易被蛋白酶降解的蛋白質(zhì)，通過沉淀過程的處理后保留了下來，從而顯示在凝膠圖譜上。我們認為，沉淀法處理后的樣品，能夠改善電泳的條件，圖譜上多出了很多有望成為胰液生物標志物的蛋白點，更提高了圖譜部分區(qū)域的分辨率，因此沉淀法可以作為胰液蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳樣品制備的有效方法。3種沉淀方法中，TCA/丙酮沉淀法與其他2種方法相比，有利于提高酸性蛋白質(zhì)的分辨率，但造成了很多蛋白點的丟失，因此不適合胰液標本的處理。而實際應用中，與2D-Cleanup試劑盒處理法相比，丙酮沉淀法具有成本低廉、操作簡便等優(yōu)勢。因此，我們認為利用丙酮沉淀法純化胰液類鹽、脂較豐富的樣品，去除干擾成分，具有較好的效果。3.2胰液蛋白質(zhì)制備中蛋白酶的添加及重溶時間的選擇Wandschneider等［4,6］認為胰液中含有大量的蛋白酶，將未經(jīng)處理的胰液樣品直接進行雙向凝膠電泳時應當使用多種多量的蛋白酶抑制劑如苯甲磺酰氟、抑酞酶等，防止胰液中蛋白質(zhì)的降解，從而提高2-DE操作的重復性。但是考慮到蛋白酶抑制劑本身對蛋白質(zhì)的修飾可能并且可以出現(xiàn)在最后的雙向凝膠電泳圖譜中［4,5］，我們根據(jù)盡可能簡化的原則僅加入PMSF，再與使用Cocktail復合蛋白酶抑制劑（Roche公司產(chǎn)品）的雙向凝膠電泳圖譜對比之后，證實完全可行，這也是建立使用丙酮沉淀法處理胰液和全程在冰上或一20笆的環(huán)境中操作，沉淀后的蛋白酶活性喪失的基礎(chǔ)上的。文獻報道［3-5］的丙酮沉淀法中，沉淀的重溶時間有多種選擇。我們分別對4h與過夜2種情況作了預試驗。結(jié)果顯示，4笆沉淀重溶過夜并不會增加蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解，且蛋白質(zhì)的溶解性還得到了顯著提高。3.3等電聚焦電泳上樣量的優(yōu)化蛋白質(zhì)的上樣量會直接影響雙向凝膠電泳圖譜的分辨率。對于18cm的膠條，圖2A加樣量略顯大（500居，點數(shù)629）,高豐度蛋白連成一片，低豐度蛋白分辨率低，嚴重影響了圖譜的后續(xù)分析。圖2B加樣量又略顯?。?00^g，點數(shù)318），雖然圖譜效果明顯好于圖2A，多數(shù)蛋白點清晰可辨，但部分低豐度蛋白卻沒有顯示出來。想要選擇一種既能提高上樣量又能獲得效果較為理想的電泳圖譜，就要在IPG膠條的選擇上做一些改進。3.4等電聚焦電泳IPG膠條pH范圍和長度的選擇商品化的IPG膠條在pH范圍上有線性與非線性，寬pH梯度與窄pH梯度之分［3］。我們通過初步試驗分析胰液中蛋白質(zhì)總體分布情況后，發(fā)現(xiàn)胰液蛋白質(zhì)主要集中于pH4?7梯度段之間，在酸堿兩端也有少量蛋白質(zhì)分布。因此，我們在胰液樣品雙向凝膠電泳時選用了pH3?10非線性的IPG膠條，既能檢測胰液蛋白質(zhì)總體分布，又能相對提高pH4?7段的分辨率，獲得更多的蛋白質(zhì)點。在IPG膠條長度的選擇上，通過圖譜分析，我們認為，使用18cm膠條低上樣量適合于胰液蛋白質(zhì)的分析，而24cm膠條高上樣量則更利于胰液蛋白質(zhì)的制備。3.5胰液相關(guān)蛋白質(zhì)的鑒定通過與前人[2]工作的比較，我們初步發(fā)現(xiàn)了10余種尚未報道的胰液相關(guān)蛋白質(zhì)。通過后續(xù)功能研究，將有可能從中發(fā)現(xiàn)可直接用于胰腺疾病檢測的生物標志物[7]。我們通過一系列相關(guān)實驗，得出了如下結(jié)論：第一，在低溫下使用丙酮沉淀法處理胰液樣品，既可以去除鹽、脂等干擾物質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的抽提率，還可以抑制蛋白酶的活性，減少蛋白質(zhì)的修飾和損失；第二，使用商品化的IPG膠條，在選取合適的長度(18/24cm)和pH范圍(pH3~10NL)的基礎(chǔ)上，適當提高上樣量(400~500^g)，并采用考馬斯亮藍R350染色可以提高胰液雙向凝膠電泳圖譜的分辨率和重復性。總之，我們對人胰液蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳的條件、標本處理等各個環(huán)節(jié)進行了調(diào)整、優(yōu)化，建立了相對穩(wěn)定的人胰液雙向凝膠電泳技術(shù)方案，初步鑒定出部分胰液蛋白質(zhì)，為建立胰液蛋白質(zhì)表達譜及進一步開展疾病相關(guān)的胰液蛋白質(zhì)組學研究打下了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。參考文獻RostyC,ChristaL,KuzdzalS,etal.Identificationofheptocarcinoma-intestine-pancreas/pancreatitis-associatedprotien1asabiomarkerforpancreaticductaladenocarcinomabyproteinbiochiptechnology[J].CancerRes,2002,62(6):1868-1875.GronborgM,BunkenborgJ,KristiansenTZ,etal.Comprehensiveproteomicanalysisofhumanpancreaticjuice[J].JProteomeRes,2004,3(5):1042-1055.ShenJ,PersonMD,ZhuJ,etal.Proteinexpressionprofilesinpancreaticadenocarcinomacomparedwithno