分子生物學(xué)實驗HBV-DNA檢測1分子生物學(xué)實驗HBV-DNA檢測1一、實驗?zāi)康?、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2、掌握乙肝病毒DNAPCR檢測方法2一、實驗?zāi)康?、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2二、實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制，利用兩段特異的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化產(chǎn)生目的基因的擴(kuò)增技術(shù)。3二、實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是在體外模擬體內(nèi)DNAPCR技術(shù)基本原理4PCR技術(shù)基本原理4目的基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù). 擴(kuò)增子數(shù)(靶序列拷貝數(shù))1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824(10億)1循環(huán)=2擴(kuò)增子2循環(huán)=4擴(kuò)增子3循環(huán)=8擴(kuò)增子4循環(huán)=16擴(kuò)增子5循環(huán)=32擴(kuò)增子6循環(huán)=64擴(kuò)增子7循環(huán)=128擴(kuò)增子5目的基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù). 擴(kuò)增子數(shù)1循環(huán)=2擴(kuò)增子2循三、實驗準(zhǔn)備（一）試劑1、DNA提取液2、PCR反應(yīng)液3、石蠟油、雙蒸水4、電泳緩沖液（TAE）5、2％瓊酯糖6、溴化乙錠（EB）7、Taq聚合酶10XPCR緩沖液dNTP引物6三、實驗準(zhǔn)備（一）試劑10XPCR緩沖液dNTP引物6三、實驗準(zhǔn)備（一）器材和儀器1、離心機(jī)2、水浴鍋3、PCR擴(kuò)增儀4、電泳槽、電泳儀5、紫外燈6、移液器7三、實驗準(zhǔn)備（一）器材和儀器7移液器加樣槍頭8移液器加樣槍頭8高速離心機(jī)旋渦振蕩器9高速離心機(jī)旋渦振蕩器9PCR擴(kuò)增儀10PCR擴(kuò)增儀10熒光定量PCR擴(kuò)增儀11熒光定量PCR擴(kuò)增儀11電泳儀電泳槽12電泳儀電泳槽12暗室中紫外燈觀察結(jié)果13暗室中紫外燈觀察結(jié)果13（一）乙肝病毒DNA提?。崃呀夥ǎ?、分離血清2、50ul血清加入50ul裂解液混勻。3、沸水浴煮10分鐘。4、15000轉(zhuǎn)離心15分鐘。5、取上清到另一離心管中備用。三、實驗步驟14（一）乙肝病毒DNA提?。崃呀夥ǎ┤?、實驗步驟14分離血清15分離血清15加入裂解液提取DNA16加入裂解液提取DNA16熱裂解17熱裂解17高速離心18高速離心18三、實驗步驟（二）HBV－DNA擴(kuò)增1、配制反應(yīng)液（15ul10×TAE，1ulTaq酶，13ul雙蒸水，1ul模板）,振蕩混勻.2、擴(kuò)增儀中：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30循環(huán)。3、72℃延伸5分鐘。19三、實驗步驟（二）HBV－DNA擴(kuò)增19配制PCR反應(yīng)液20配制PCR反應(yīng)液20三、實驗步驟（三）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測1、配制2％瓊酯糖的凝膠2、取擴(kuò)增產(chǎn)物10ul加入凝膠小孔中3、電泳30分鐘4、紫外燈下觀察結(jié)果。21三、實驗步驟（三）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測21擴(kuò)增產(chǎn)物分析22擴(kuò)增產(chǎn)物分析221．分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為樣品處理區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)。2、試驗前實驗室應(yīng)使用紫外消毒至少30分鐘，實驗器械應(yīng)用70％乙醇擦拭。3．操作時戴一次性手套，加樣頭要求及時更換，吸液時避免飛濺。四、注意事項231．分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作4．每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實驗時將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5、EP管在開蓋前應(yīng)離心片刻。6、所有試劑試驗前充分融化，避免反復(fù)凍融。7、每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。四、注意事項244．每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次試驗實設(shè)置與管理25試驗實設(shè)置與管理25PCR室的管理與防污染PCR室建立嚴(yán)格規(guī)章制度PCR室嚴(yán)格分區(qū)PCR室各區(qū)器械專區(qū)使用PCR室各區(qū)單向流動PCR檢測前后要用1％次氯酸鈉液或75％乙醇擦拭PCR反應(yīng)液中使用dUTP防污染26PCR室的管理與防污染PCR室建立嚴(yán)格規(guī)章制度262727試劑準(zhǔn)備室管理制度

實驗室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套。每天實驗開始前，清潔臺面并應(yīng)打開紫外燈消毒30分鐘。取出當(dāng)天試驗需配置和使用試劑，其余試劑要立即收好，并放回冰箱內(nèi)。實驗中使用的離心管、吸頭等應(yīng)經(jīng)過滅活無菌處理（應(yīng)在消毒的有效期內(nèi)）。PCR其他室的用品不得帶入本室。每次實驗記錄，應(yīng)使用本室專用的、帶有本室標(biāo)志的記錄本、紙和筆。實驗開始后，當(dāng)天不得再返回本室。28試劑準(zhǔn)備室管理制度實驗室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實2929樣品制備室管理制度實驗人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。樣品的接受、登記、保存和提取按試劑盒要求進(jìn)行。使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。使用過的離心管、吸頭須置于1％次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。患者樣品按有生物傳染危險品對待，應(yīng)高壓滅活后棄之。PCR擴(kuò)增后區(qū)的物品不得帶入本室。實驗完畢后要打開紫外燈消毒。30樣品制備室管理制度實驗人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中產(chǎn)物分析區(qū)管理制度

實驗人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。使用過的離心管、吸頭須置于1％次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。PCR產(chǎn)物分析區(qū)的物品不得帶出本室，嚴(yán)防污染攜帶至前區(qū)。實驗完畢后要打開紫外燈消毒，最好通夜消毒。31產(chǎn)物分析區(qū)管理制度實驗人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實驗定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量32定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或常規(guī)PCR與定量PCR的比較33常規(guī)PCR與定量PCR的比較33實時熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定義：每個反應(yīng)管的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle0-1534實時熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。35Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3836熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoi除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的5'端標(biāo)記一個熒光基團(tuán)，3'標(biāo)記另一個熒光基團(tuán)。此時5'端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生FRET），因此正常情況下檢測不到該探針5'端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號。

Taqman探針原理37除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個能與PCR產(chǎn)但當(dāng)溶液中有模板時，模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；

Taqman探針原理38但當(dāng)溶液中有模板時，模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模Taqman探針原理Taq酶的5'—3’外切酶活性將探針5'端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光，切割的熒光基團(tuán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例。因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計算出初始模板的數(shù)量。39Taqman探針原理Taq酶的5'—3’外切酶活性將探針5'實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)Ct值的重現(xiàn)性:同一模板Ct值恒定.Ct值與起始模板的線性關(guān)系決定.內(nèi)標(biāo)對實時熒光定量PCR有影響:加入內(nèi)標(biāo)后PCR反應(yīng)變成雙重PCR,存在競爭。無法加入合適的起始拷貝的內(nèi)標(biāo)。40實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)Ct值的重現(xiàn)性:同一模板Ct值恒定定量PCR在臨床診斷治療上的意義對致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測彌補(bǔ)免疫檢測的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HBV,HIV）對治療過程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測指導(dǎo)用藥加快疾病的診斷，病情判斷預(yù)后對染色體突變導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測41定量PCR在臨床診斷治療上的意義對致病微生物核酸含量進(jìn)行定量定量PCR在乙肝檢測中意義1.判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性2.PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評價3.觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量4.獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷5.預(yù)測病情、判斷預(yù)后6.器官移植、母嬰垂直傳播42定量PCR在乙肝檢測中意義1.判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性44343444445454646HBVDNA定量檢測能提前做出預(yù)后判斷目前指標(biāo)：1.

e抗原陰轉(zhuǎn)2.

HBV病毒載量小于104拷貝/ml3.

ALT正常4.

e抗體由陰轉(zhuǎn)陽47HBVDNA定量檢測能提前做出預(yù)后判斷目前指標(biāo)：47LightCycler748LightCycler748謝謝！49謝謝！49分子生物學(xué)實驗HBV-DNA檢測50分子生物學(xué)實驗HBV-DNA檢測1一、實驗?zāi)康?、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2、掌握乙肝病毒DNAPCR檢測方法51一、實驗?zāi)康?、熟悉乙肝病毒DNA提取方法2二、實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制，利用兩段特異的寡核酸引物，由DNA聚合酶催化產(chǎn)生目的基因的擴(kuò)增技術(shù)。52二、實驗原理聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)是在體外模擬體內(nèi)DNAPCR技術(shù)基本原理53PCR技術(shù)基本原理4目的基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù). 擴(kuò)增子數(shù)(靶序列拷貝數(shù))1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,824(10億)1循環(huán)=2擴(kuò)增子2循環(huán)=4擴(kuò)增子3循環(huán)=8擴(kuò)增子4循環(huán)=16擴(kuò)增子5循環(huán)=32擴(kuò)增子6循環(huán)=64擴(kuò)增子7循環(huán)=128擴(kuò)增子54目的基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù). 擴(kuò)增子數(shù)1循環(huán)=2擴(kuò)增子2循三、實驗準(zhǔn)備（一）試劑1、DNA提取液2、PCR反應(yīng)液3、石蠟油、雙蒸水4、電泳緩沖液（TAE）5、2％瓊酯糖6、溴化乙錠（EB）7、Taq聚合酶10XPCR緩沖液dNTP引物55三、實驗準(zhǔn)備（一）試劑10XPCR緩沖液dNTP引物6三、實驗準(zhǔn)備（一）器材和儀器1、離心機(jī)2、水浴鍋3、PCR擴(kuò)增儀4、電泳槽、電泳儀5、紫外燈6、移液器56三、實驗準(zhǔn)備（一）器材和儀器7移液器加樣槍頭57移液器加樣槍頭8高速離心機(jī)旋渦振蕩器58高速離心機(jī)旋渦振蕩器9PCR擴(kuò)增儀59PCR擴(kuò)增儀10熒光定量PCR擴(kuò)增儀60熒光定量PCR擴(kuò)增儀11電泳儀電泳槽61電泳儀電泳槽12暗室中紫外燈觀察結(jié)果62暗室中紫外燈觀察結(jié)果13（一）乙肝病毒DNA提?。崃呀夥ǎ?、分離血清2、50ul血清加入50ul裂解液混勻。3、沸水浴煮10分鐘。4、15000轉(zhuǎn)離心15分鐘。5、取上清到另一離心管中備用。三、實驗步驟63（一）乙肝病毒DNA提?。崃呀夥ǎ┤?、實驗步驟14分離血清64分離血清15加入裂解液提取DNA65加入裂解液提取DNA16熱裂解66熱裂解17高速離心67高速離心18三、實驗步驟（二）HBV－DNA擴(kuò)增1、配制反應(yīng)液（15ul10×TAE，1ulTaq酶，13ul雙蒸水，1ul模板）,振蕩混勻.2、擴(kuò)增儀中：94℃30秒，55℃30秒，72℃1分鐘，共30循環(huán)。3、72℃延伸5分鐘。68三、實驗步驟（二）HBV－DNA擴(kuò)增19配制PCR反應(yīng)液69配制PCR反應(yīng)液20三、實驗步驟（三）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測1、配制2％瓊酯糖的凝膠2、取擴(kuò)增產(chǎn)物10ul加入凝膠小孔中3、電泳30分鐘4、紫外燈下觀察結(jié)果。70三、實驗步驟（三）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測21擴(kuò)增產(chǎn)物分析71擴(kuò)增產(chǎn)物分析221．分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作，即分為樣品處理區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)。2、試驗前實驗室應(yīng)使用紫外消毒至少30分鐘，實驗器械應(yīng)用70％乙醇擦拭。3．操作時戴一次性手套，加樣頭要求及時更換，吸液時避免飛濺。四、注意事項721．分區(qū)操作：PCR具有超敏感性，因此在檢測過程中應(yīng)分區(qū)操作4．每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次氯酸鈉液，實驗時將吸頭、離心管丟入廢液缸中浸泡。5、EP管在開蓋前應(yīng)離心片刻。6、所有試劑試驗前充分融化，避免反復(fù)凍融。7、每次PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)立陰陽性對照。四、注意事項734．每天實驗前，在廢物缸內(nèi)套上塑料袋，加入半缸含有效氯1%次試驗實設(shè)置與管理74試驗實設(shè)置與管理25PCR室的管理與防污染PCR室建立嚴(yán)格規(guī)章制度PCR室嚴(yán)格分區(qū)PCR室各區(qū)器械專區(qū)使用PCR室各區(qū)單向流動PCR檢測前后要用1％次氯酸鈉液或75％乙醇擦拭PCR反應(yīng)液中使用dUTP防污染75PCR室的管理與防污染PCR室建立嚴(yán)格規(guī)章制度267627試劑準(zhǔn)備室管理制度

實驗室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套。每天實驗開始前，清潔臺面并應(yīng)打開紫外燈消毒30分鐘。取出當(dāng)天試驗需配置和使用試劑，其余試劑要立即收好，并放回冰箱內(nèi)。實驗中使用的離心管、吸頭等應(yīng)經(jīng)過滅活無菌處理（應(yīng)在消毒的有效期內(nèi)）。PCR其他室的用品不得帶入本室。每次實驗記錄，應(yīng)使用本室專用的、帶有本室標(biāo)志的記錄本、紙和筆。實驗開始后，當(dāng)天不得再返回本室。77試劑準(zhǔn)備室管理制度實驗室人員進(jìn)入該室須穿專用白色工作服，實7829樣品制備室管理制度實驗人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。樣品的接受、登記、保存和提取按試劑盒要求進(jìn)行。使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。使用過的離心管、吸頭須置于1％次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄?；颊邩悠钒从猩飩魅疚ｋU品對待，應(yīng)高壓滅活后棄之。PCR擴(kuò)增后區(qū)的物品不得帶入本室。實驗完畢后要打開紫外燈消毒。79樣品制備室管理制度實驗人員進(jìn)入該室須穿專用蘭色工作服，實驗中產(chǎn)物分析區(qū)管理制度

實驗人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實驗中應(yīng)需戴手套，手套須常更換。使用本室專用的經(jīng)滅菌處理的加樣器和帶濾芯的吸頭。實驗記錄使用本室專用記錄本和筆。使用過的離心管、吸頭須置于1％次氯酸鈉溶液中浸泡，消毒后方可丟棄。PCR產(chǎn)物分析區(qū)的物品不得帶出本室，嚴(yán)防污染攜帶至前區(qū)。實驗完畢后要打開紫外燈消毒，最好通夜消毒。80產(chǎn)物分析區(qū)管理制度實驗人員進(jìn)入該室須穿專用紅色工作服，實驗定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測，對PCR起始模板量的定量81定量PCR概念以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對PCR終產(chǎn)物的分析或常規(guī)PCR與定量PCR的比較82常規(guī)PCR與定量PCR的比較33實時熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號的積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。Ct（cyclethreshold)值定義：每個反應(yīng)管的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值（threshold)的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold=10×SDcycle0-1583實時熒光定量PCR原理指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。84Ct值與起始模板的關(guān)系每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3885熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本CrossingPoi除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的5'端標(biāo)記一個熒光基團(tuán)，3'標(biāo)記另一個熒光基團(tuán)。此時5'端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3’端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生FRET），因此正常情況下檢測不到該探針5'端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號。

Taqman探針原理86除常規(guī)的一對引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個能與PCR產(chǎn)但當(dāng)溶液中有模板時，模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換；

Taqman探針原理87但當(dāng)溶液中有