第三章生物信息的傳遞（上）

－從DNA到RNA3.1RNA的轉(zhuǎn)錄3.2啟動子與轉(zhuǎn)錄起始3.3原核生物與真核生物mRNA的特征比較3.4終止與抗終止3.5內(nèi)含子的剪接、編輯及化學修飾DNA序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成信使RNA、翻譯生成蛋白質(zhì)的過程來控制生命現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄(transcription)基因表達翻譯(translation)拷貝出一條與DNA鏈序列完全相同(U替換T)的RNA單鏈的過程，是基因表達的核心步驟；以新生的mRNA為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子翻譯成氨基酸序列、合成多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。DNARNAProtein轉(zhuǎn)錄翻譯

轉(zhuǎn)錄(transcription):是指以DNA為模板，在依賴于DNA的

RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、

CTP、GTP和UTP）為原料，合成RNA

的過程。

Content:一、Somebasicconception二、TranscriptionintheProkaryoticNucleus三、TranscriptionintheEukaryoticNucleus四、mRNADifferencesbetweenProkaryotesandeukaryotes五、ProductionofmaturemRNAinEukaryotes一、Somebasicconception

1.GeneAregionofaDNAmoleculecontainingasequenceofbasesthatistranscribedintoafunctionalproduct.Severalregionsareresponsiblefortheproperfunctionofagene.Regulatoryregion-sequenceofbasesthatcontroltheinitiationoftranscription.Codingregion-sequenceofbasesthatarereadintoafunctionalmolecule(RNAorprotein).Terminationregion-sequenceofnucleotidesthatstopstranscription.2.Whenaproteinisneededbyacell,thegeneticcodeforthatproteinmustbereadfromtheDNAandprocessed.Atwostepprocess:（1）Transcription=synthesisofasingle-strandedRNAmoleculeusingtheDNAtemplate(1strandofDNAistranscribed).InEukaryotes,transcriptiontakesplaceinthenucleus.（2）Translation=conversionofamessengerRNAsequenceintotheaminoacidsequenceofapolypeptide(i.e.,proteinsynthesis)Translationtakesplaceonribosomesinthecytosol,oronroughER3.Templatestrandandnontemplatestrand

Templatestrand:The3’to5’strandofDNAinacodingregionthatservesasthetemplateforRNAsynthesis.TheresultingRNAisacomplementofthetemplatestrand.

Nontemplatestrand:The5’to3’strandofDNAinacodingregionthathasnofunctioninproducingtheRNA.IthasthesamesequenceastheinitiallytranscribedRNA,exceptthatThymineintheDNAisUracilintheRNA.TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’

有義鏈(sensestrand)[又稱編碼鏈codingstrand]:

指不作模板的DNA單鏈

反義鏈(antisensestrand)[又稱模板鏈templatesrand]:指作為模板進行RNA轉(zhuǎn)錄的鏈

(60年代以前的表示方法與此相反)

沒有A＝UG＝C的規(guī)律Sense/antisense+/-Nontranscribed/transcribedNontemplate/templatecoding/template4.Conventionsfordescribingthestrands5.BothstrandsencodegenesEitherstrandofaDNAmoleculemaybeusedasatemplate,buttranscriptionalwaysreadsthe3’to5’strandrelativetothedirectionofRNApolymerasemovement.

6.轉(zhuǎn)錄的不對稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性mRNA--(messenger)intermediatemoleculesusedfortransferofinformationfromDNAtoprotein.rRNA--(ribosomal)functionalRNAmoleculesthatarecomponentsoftheribosome.tRNA--(transfer)functionalRNAmoleculesthatserveasadaptersintranslation.snRNA--(smallnuclear)functionalRNAmoleculesthatareinvolvedintheremovalofintronsfrompre-mRNAs.scRNA--(smallcytoplasmic小胞漿RNA)functionalRNAmoleculesthatareinvolvedinproteintrafickingwiththecytoplasm.i.e.scRNA參與蛋白質(zhì)的合成和運輸7.FivedifferenttypesofRNA:8.HowisanRNAstrandsynthesized?Regulatedbygeneregulatoryelementswithineachgene.DNAunwindsnexttoagene.RNAistranscribed5’to3’fromthetemplate(3’to5’).SimilartoDNAsynthesis,except:RNApolymeraseNoprimerNoproofreadingNTPsinsteadofdNTPs(nodeoxy-)AddsUracil(U)insteadofthymine(T)UnlikeDNAreplication,wewillonlywanttocopyspecificsequencesatspecifictimesinspecificcelltypesWewillneedspecificstartandstopsignalsOnlyonestrandwillbecopied二、TranscriptionintheProkaryoticNucleusThereisonlyoneRNApolymeraseinE.coliResponsibleforthesynthesisofalltypesofRNAWewillfirstlookatthecoreenzymeandthenattheholoenzymeDs-DNAdependent

DS-DNA?Ss-DNA?SS-RNA?RNA-DNA?1.E.coliRNApolymeraseCapableofpolymerizationbutnotinitiation（1）RNApolymerasecoreenzymeCoreenzyme+sigmafactorThesigmafactorisaseparateproteinrequiredforinitiationTherearemanydifferentsigmafactorsDifferentsigmafactorsallowfortheexpressionofdifferentgenes（2）RNApolymeraseholoenzymea2bb’sa2bb’+sholoenzymecorepolymerasesigmafactor（3）TherolesofeachsubunitPhosphodiesterbondformationDNAbindingDNAbindingAssembleholoenzyme大腸桿菌中的σ因子能識別并與啟動子區(qū)的特異性序列相結合因子基因功能-35區(qū)間隔（bp）-10區(qū)σ70rpoD廣泛TTGACA16-18TATAATσ32rpoH熱休克TCTCNCCCTTGAA13-15CCCCATNTAσ54rpoN氮代謝CTGGNA6TTGCA

①核心酶（CoreEnzyme）

?作用于轉(zhuǎn)錄的延伸過程（終止）

?依靠靜電引力與DNA模板結合（蛋白質(zhì)中堿性基團與DNA的磷酸根之間）

?非專一性的結合（與DNA的序列無關）

?結合常數(shù)：1011／mol②全酶（HoloEnzyme）

?用于轉(zhuǎn)錄的起始

?依靠空間結構與DNA模板結合(σ與核心酶結合后引起的構象變化)?專一性地與DNA序列(啟動子)結合

?結合常數(shù)：1014／mol?半衰期：數(shù)小時

?轉(zhuǎn)錄效率低，速度緩慢（σ的結合

）

此外，新發(fā)現(xiàn)的一種ω亞基的功能尚不清楚。2、各亞基的特點和功能（1）σ

因子（sigmafactor）

?σ因子可重復使用

?修飾RNApol構型

?使HoloEnzyme識別啟動子的－35區(qū),并通過σ與模板鏈結合2α

＋βα2ββ’＋σ

α

2β

＋β’α2ββ’σ（3）全酶的組裝過程

?不同的σ因子識別不同的啟動子

E.coli中有四種σ因子（σ70、σ32、σ54、σ28）枯草桿菌中有6種σ因子（σ因子的更替對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控）（2）α因子?核心酶的組建因子

?促使RNApol與DNA模板鏈結合α＋α2α＋β

α2β＋β’

?前端α因子－－使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈

?尾端α因子－－使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈（3）β因子?促進RNApol＋NTPRNAelongation

?完成NMP之間的磷酸酯鍵的連接

?Editing功能（排斥與模板鏈不互補的堿基）

?與Rho（ρ）因子競爭RNA3’－end

（4）β’因子

?參與RNA非模板鏈（sensestrand）的結合（充當SSB）由于各亞基的功能，使全酶本身含有五個功能位點

有義DNA鏈結合位點（

β’亞基提供）

DNA/RNA雜交鏈結合位點（β亞基提供）雙鏈DNA解鏈位點（前端α亞基提供）單鏈DNA重旋位點（后端α亞基提供）

σ因子作用位點

Thefunctionofsigmafactor

thesigmasubunitofRNApolymeraseisan“initiationfactor”thereareseveraldifferentsigmafactorsinE.colithatare specificfordifferentsetsofgenes

sigmafactorfunctionstoensurethatRNApolymerasebinds stablytoDNAonlyatpromoterssigmadestablizesnonspecificbindingtonon-promoterDNAsigmastabilizesspecificbindingtopromoterDNAthisacceleratesthesearchforpromoterDNA

Ka(M-1)

AnyDNA PromoterDNA

(nonspecific)

(specific)Core 2X1011Holo 1X107 1013to1015CoreEnzyme

具有的四個功能位點

ααβ’β★DNA/RNA雜交位點(β)

★D.S.DNA解鏈位點(α)

★D.S.DNA重旋(α)

★啟動子識別位點

σ★DNA有義鏈結合位點(β’)

RNA聚合酶全酶及核心酶電泳圖譜Thefidelity（保真性）

ofRNApolymeraseNoproofreadingnucleaseactivities1errorin105bpAbout105lowerthanreplication（4）PromoterADNAsequencethatdirectsthetranscriptionofadjacentsegmentsoftheDNA啟動子(promoter)：是指DNA分子上被RNA聚合酶識別并結合形成起始轉(zhuǎn)錄復合物的區(qū)域，它還包括一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結合位點。酶與模板的辯認結合

1、轉(zhuǎn)錄起始點——開始轉(zhuǎn)錄的位點，常標以+12、結合部位——約為7個堿基長度，其中心位于上游-10bp處被稱為–10區(qū)或Pribnow盒(TATA盒）。該區(qū)具高度保守性，并易解鏈。

3、識別部位——RNA聚合酶亞基識別的部位，約含6個堿基長度，其中心位于上游-35bp處被稱為–35區(qū)。啟動序列(原核）TGTTGACATATAAT3'5'5‘3'DNA編碼鏈模板鏈-35區(qū)-10區(qū)+15‘McGPPP轉(zhuǎn)錄起始部位啟動子基因轉(zhuǎn)錄區(qū)RNA產(chǎn)物NH2翻譯開始轉(zhuǎn)錄開始Recognitionsequencesinthepromoter-10consensussequence:TATAAT-35consensussequence:TTGACA①

—10序列（PribonowBox）

§-10序列，RNA聚合酶的牢固結合位點結合位點（B位點）

§一致序列：T80A95T45A60A50T96）

§位置范圍－4到－13因此又稱TATABox保守TTATA區(qū)：酶的緊密結合位點（富含AT堿基，利于雙鏈打開）

②—35序列

§—35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）結合位點

§RNA聚合酶依靠其σ亞基識別該位點

§大多數(shù)啟動子中共有序列為T82T84G78A65C54A45§重要性:很大程度上決定了啟動子的強度

§

位置在不同啟動子中略有變動TTGACA區(qū)：提供了RNA聚合酶全酶識別的信號HowdoesRNApolymerasefindthepromoter?RNApolymerasescansDNAlinearlySlidesalongDNAwithoutopeningstrandsDetectssequencesof-10and-35inthemajorgrooveSigmafactorallowsRNApolymerasetobindtopromoter5.原核生物轉(zhuǎn)錄起始過程：

a.全酶與啟動子結合的封閉型啟動子復合物的形成（

R位點被σ因子發(fā)現(xiàn)并結合）

b、開放型啟動子復合物的形成

§RNApol的一個適合位點到達－10序列區(qū)域，誘導富含A·T的Pribnow框的“熔解”，形成12－17bp的泡狀物，同時酶分子向－10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結合

§開放型啟動子復合物使RNApol聚合酶定向

§兩種復合物均為二元復合物（全酶和DNA）12～17bp

c.在開放型的啟動子復合物中，RNApol的I位點和E位點的核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（

β

亞基）三元復合物形成

+1位多為CAT模式,位于離開保守T6~9個核苷酸處

---6-9bp---

GCTATTGACATATAAT-----16-19bp-------+1-35sequence-10sequence（4）σ因子解離→核心酶與DNA的親和力下降起始過程結束→核心酶移動進入延伸過程轉(zhuǎn)錄的起始過程σ核心酶12～17bp（β亞基）CAP-cAMP結合位點（也稱CAP位點）轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，I→阻遏蛋白→負調(diào)控

lac

操縱子模型I

許多基因的表達還存在正調(diào)控機制例如:E.coli培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時→只有葡萄糖被利用原因：CAP位點的正調(diào)控

?葡萄糖缺少時，腺苷酸環(huán)化酶將ATP→cAMP，

cAMP與CAP位點結合,此時啟動子的進入位點才能與RNApol結合

?葡萄糖存在時，cAMP不能形成，沒有CAP－cAMP

與CAP位點結合，啟動子的RNApol進入位點不能結合RNApol

因此,一個操縱元中有兩道控制開關,只有同時打開,結構基因才能進行轉(zhuǎn)錄。（對lac操縱元而言，只有沒有葡萄糖，有乳糖時才能進行錄）（1）CAP位點的組成（－70～－40）位點Ⅰ：－70～－50

強結合位點位點Ⅱ：－50～－40弱結合位點位點Ⅰ對位點Ⅱ具有協(xié)同效應（cooperativity）（2）位點Ⅱ結合CAP－cAMP復合物后，促使RNApol進入

SextamaBox,最終與－10序列結合起始轉(zhuǎn)錄原因：CAP－cAMP復合物與位點Ⅱ結合→SextamaBox富含G.C區(qū)域（G.C島區(qū)）穩(wěn)定性降低→

PribnowBox的溶解溫度降低→促進開放型啟動子復合物的形成→促進轉(zhuǎn)錄RNApol在DNA上結合位點的鑒定

DNase法----------40bp

而足跡法（footprinting）結果相對準確足跡法原理：

?限制酶切割結合有RNApol的DNA→大分子DNA?末端標記該DNA（Klenow片段標記3′,堿性磷酸酯酶標記5′）

?用內(nèi)切酶降解DNA（控制反應條件）

?凝膠電泳分離，放射自顯影觀察6、啟動子各位點與轉(zhuǎn)錄效率的關系（1）－35序列與－10序列與轉(zhuǎn)錄效率的關系標準啟動子－35TTGACA

－10TATAAT不同的啟動子的區(qū)別：

a.與標準啟動子序列同源性越高→啟動強度越大

b.與標準啟動子同源性越低→啟動強度越小

c.與標準啟動子差異很大時→由另一種σ因子啟動原因:

?－35序列通過被σ因子識別的容易程度→決定啟動子強度

?－10序列影響開放型啟動子復合物形成的速度→決定啟動子強度

（2）－35序列與－10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關系◆堿基序列并不重要◆間距非常重要，17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高◆間距上的突變種類：間距趨向于17bp→上升突變間距遠離17bp→下降突變ThefirsteventsatthepromoterRNApolymerasebindstothe-35regionThisiscalledaclosedcomplexbecausetheDNAisstillbase-paired7.StepsofTranscription當聚合酶按5′→3′方向延伸RNA鏈時，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動。聚合酶可以橫跨約40個堿基對，而解旋的DNA區(qū)域大約是17個堿基對。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA鏈上，并形成DNA-RNA雜合體。隨著聚合酶在模板上的運動，靠近3′端的DNA不斷解旋，同時在5′端重新形成DNA雙鏈，將RNA鏈擠出DNA-RNA雜合體。RNA的3′端大約有20～30個核苷酸與DNA和聚合酶相結合。BandingInitiationElongationTerminationOccurinbothprokaryotesandeukaryotes.Elongationisconservedinprokaryotesandeukaryotes.Initiationandterminationproceeddifferently.Step2-Initiation

--TranscriptionbeginsbytheassemblyoftheRNApolymeraseholoenzymeonapromoterregion.

E.colimodel:Eachgenehasthreeregions:5’Promoter,attractsRNApolymerase e.g.,-10bp5’-TATAAT-3’ e.g.,-35bp5’-TTGACA-3’Transcribedsequence,orRNAcodingsequence3’Terminator,signalsthestoppoint

MinusnumbersrepresentbasesupstreamofmRNAstartpoint,+1isthefirstbaseintheRNAtranscript.RNApolymerasecombineswithsigmafactor(apolypeptide)tocreateRNApolymeraseholoenzymeRecognizespromotersandinitiatestranscription.Sigmafactorrequiredforefficientbindingandtranscription.Differentsigmafactorsrecognizedifferentpromotersequences.RNApolymeraseholoenzymebindspromotersanduntwistsDNAe.g.,bindslooselytothe-35promoter(DNAisd.s.)e.g.,bindstightlytothe-10promoteranduntwistsDifferenttypesandlevelsofsigmafactorsinfluencethelevelanddynamicsofgeneexpression.InitiationPolymeraseboundtightlytopromoter,“ClosedComplex”PolymeraseunwindsDNA(-10to+3),“OpenComplex”StartssynthesizingRNAStep3-Elongation…

--RNApolymerizationwithinamovingbubble(about18bases)ofmeltedhelix.RibonucleosidetriphosphatesserveastheprecursorsforsynthesizingRNA.Exceptforthefirst,allribonucleotidesareaddedtoanexisting3’hydroxylgroupofanexistingnucleotide.Twoexternalphosphatesarelostastheinternalformsaphosphodiesterbondwiththehydroxylgroupatthe3’carbonoftheribose.Duetothischemistry,anRNAmoleculegrowsatits3’end,thusissynthesizedina5’to3’direction.ThesequenceoftheRNAisdictatedbythetemplatestrandofDNA,whichisorganized3’to5’relativetothedirectionoftranscription.After8-9bpofRNAsynthesisoccurs,sigmafactorisreleasedandrecycledforotherreactions.RNApolymerasecompletesthetranscriptionat30-50bp/second.DNAuntwistsrapidly,andre-annealsbehindtheenzyme.PartofthenewRNAstrandishybridDNA-RNA,butmostRNAisdisplacedasthehelixreforms.After~10nucleotideshavebeenadded,5’endribonucleotideunpairsfromtemplate.Thessubunitdissociatesfromcore.ThesizeofRNA-DNAhybridmaintainedduringelongation.Sigmarecyclestonewpolymerasemolecules.延伸過程（Prok）

★酶與產(chǎn)物RNA不解離

★底物NTP不斷加到RNA鏈的3’-OH端★形成一個磷酸二酯鍵后，核心酶向前滑動★延伸位點不斷地接受新的NTP，RNA鏈不斷延伸

?始終保持三元復合物的結構

1、轉(zhuǎn)錄泡★RNApol結合和轉(zhuǎn)錄的DNA模板區(qū)域，有17bp左右

DNA形成解鏈區(qū)★轉(zhuǎn)錄泡處雜交雙鏈很短

2、拓撲學問題

Φ

RNA合成過程中，轉(zhuǎn)錄泡兩端要發(fā)生拓撲轉(zhuǎn)變

?RNApol的前沿…..解螺旋作用

?RNApol后端…..DNA的螺旋化

Φ

超纏問題的解決靠DNA旋轉(zhuǎn)酶

Φ

RNA-DNA雜交鏈也要求作旋轉(zhuǎn)運動當聚合酶按5′→3′方向延伸RNA鏈時，解旋的DNA區(qū)域也隨之移動。聚合酶可以橫跨約40個堿基對，而解旋的DNA區(qū)域大約是17個堿基對。自由核苷酸能被聚合酶加到新生的RNA鏈上，并形成DNA-RNA雜合體。隨著聚合酶在模板上的運動，靠近3′端的DNA不斷解旋，同時在5′端重新形成DNA雙鏈，將RNA鏈擠出DNA-RNA雜合體。RNA的3′端大約有20～30個核苷酸與DNA和聚合酶相結合。Step4-Termination…

--stoppingthesynthesisofanRNADifferentmechanismsofterminationProkaryotesrho-independenttermination:formationofahairpinstructurerho-dependenttermination:externalproteindisruptstranscriptionEukaryotescleavageoftheRNAbyanexternalprotein☆終止過程：酶停止添加底物→→釋放RNA鏈→→酶解離終止反應…雜合雙鏈的氫鍵斷裂，

…重新形成雙螺旋，酶的解離。☆終止子（terminator）：在轉(zhuǎn)錄的過程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號的RNA序列真正起終止作用的是RNA序列－－－與啟動子不同☆Prok.和Euk.都具有－－－－一種基因表達調(diào)控的手段Twotypesofterminatorsequencesoccurinprokaryotes:TypeI(-independent) inverserepeatformsahairpinloopandisbelievedtodestabilizetheDNA-RNAhybrid.TypeII(-dependent) Involvesfactorproteins,believedtobreakthehydrogenbondsbetweenthetemplateDNAandRNA.（一）RhoindependentHairpinsandpoly(U)stretchHairpinsareformedbytranscriptionofpalindromes“Hairpin”WeakassociationA:UbasepairsareweakerthanG:C’s.StopsignalsexistattheendofthetranscriptTheterminatedmessage

不依賴ρ因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄（1）新生RNA鏈發(fā)夾結構形成

與RNApol發(fā)生作用

（2）RNApol暫停為終止提供了機會，6~8個連續(xù)的U

串可能為RNApol與模板的解離提供了信號

RNA－DNA之間的rU－dA結合力較弱RNApol暫停

于是：RNA－DNA解離三元復合體解體

RNApol解離轉(zhuǎn)錄終止（3）真正的終止點不固定，在U串中的任何一處（4）IR序列和U串同等重要

IR中的G／C對含量的減少

U串的縮短或缺失（5）DNA上與U串對應的為富含A／T的區(qū)域說明：AT富含區(qū)在轉(zhuǎn)錄的終止和起始中均起重要的作用（二）RhodependentRhofactorhasanATP-dependentRNA-DNAhelicaseactivityStillhaveahairpinbutnopoly(U)stretchInbothcases,thesignaltoterminatetranscriptionispresentinthenewlytranscribedRNA,notintheDNA依賴ρ因子的終止子（1）結構

IR序列中的G／C對含量較少發(fā)夾結構末端沒有固定特征（2）靠與ρ因子的共同作用而實現(xiàn)終止無連續(xù)U串G/C含量較少

2、依賴ρ因子的終止子終止轉(zhuǎn)錄（1）通讀（readthrough）：在依賴ρ

因子的轉(zhuǎn)錄終止過程中，RNApol轉(zhuǎn)錄了IR序列之后，雖發(fā)生一定時間的暫停，但如果沒有ρ

因子存在，則

RNApol會繼續(xù)轉(zhuǎn)錄（2）ρ因子活性形式為六聚體蛋白，NTPase活性

（3）ρ因子對終止子的作用

a、ρ因子與RNA結合（終止子上游的某一處，RNA的5’端）

b、ρ因子沿RNA從5’→3’移動（NTP水解供能）（RNApol在終止子處的較長時間的暫停給ρ因子追趕的機會）

c、ρ因子與RNApol相互作用而造成轉(zhuǎn)錄的終止Ρ因子結合上來追趕RNApolΡ因子追趕上來（暫停）

ρ因子與RNApol相互作用使雜交鏈解鏈終止子RhodependentterminationATP

依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止因子：六聚體蛋白（275kDa），水解NTP沿RNA鏈移動，趕上RNApol并促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。

Rho-Dependent:“Rho”isabacterialTerminationFactorItactsasahexamerof46kDsubunits-bindsaspecific72basesequenceofssRNAItthenhydrolysesATPandeventuallydisruptspairingbetweenthenascentstrand&templatePolymerasemovementandsupercoilingProductionofthemRNAmolecule:Threemainparts:5’untranslatedregion(UTR)leadersequenceCodingsequence,specifiesaminoacidstobetranslated3’untranslatedregion(UTR)trailersequence三、TranscriptionintheEukaryoticNucleus1.ProkaryotespossessonlyonetypeofRNApolymerasetranscribesmRNAs,tRNAs,andrRNAsTranscriptionismorecomplicatedineukaryotes2.EukaryotespossessthreeRNApolymerases:（1）RNApolymeraseI,transcribesthreemajorrRNAs12S,18S,5.8S（2）RNApolymeraseII,transcribesmRNAsandsomesnRNAs（3）RNApolymeraseIII,transcribestRNAs,5SrRNA,andsnRNAsSummaryofRNAProlesandlocation

真核生物RNA聚合酶一般有8-14個亞基組成，相對分子質(zhì)量超過5×105遵循兩條原則：1.聚合酶中有兩個相對分子質(zhì)量超過1×105的大亞基。2.同種生物3類聚合酶有共享小亞基的傾向。除了細胞核內(nèi)存在RNA聚合酶外，線粒體和葉綠體內(nèi)也存在不同的RNA聚合酶，與噬菌體或細菌的有同源性。

1、RNApolⅡ的啟動子

?結構最復雜

?位于轉(zhuǎn)錄起始點的上游,有多個短序列元件組成

?通用型啟動子（無組織特異性）（1）TATA框（Hogness框或Goldberg-Hogness框）

?位于－25~—30處

?一致序列為T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）

?定位轉(zhuǎn)錄起始點的功能（類似原核的Pribnow框）

?TATA是絕大多數(shù)真核基因的正確表達所必需的（2）CAAT框（CAATbox）

?位于－70~-80區(qū)處

?一致序列為GGC/TCAATCT?前兩個G的作用十分重要(轉(zhuǎn)錄效率)?增強啟動子的效率、頻率，不影響啟動子的特異性（3）GCbox

在-80~-110區(qū)，含有GCCACACCC或GGGCGGG序列以上三個保守序列在絕大多數(shù)啟動子中都存在（4）不同元件的組合情況不同元件的數(shù)目、位置、和排列方向均有差異例如：SV40的早期啟動子中有6個GC框真核基因的啟動子:

在-25～-35區(qū)含有TATA序列;

在-70--80區(qū)含有CCAAT序列(CAATbox);

在-80－-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列(GCbox)。習慣上將TATA區(qū)上游的保守序列稱為:

上游啟動子元件(upstreampromoterelement，UPE)

或稱上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)。

比較原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)的結構，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在很大的差別：

原核基因:

啟動區(qū)范圍較小，一般情況下，TATAAT(Pribnow區(qū))的中心位于-7－-10，上游-30－-70區(qū)為正調(diào)控因子結合序列，+1－-20區(qū)為負調(diào)控因子結合序列。

真核基因:

調(diào)控區(qū)較大，TATAA/TA區(qū)位于-20－-30，而-40－-1l0區(qū)為上游激活區(qū)。

原核基因:

除Pribnow區(qū)之外，啟動子上游只有TTGACA區(qū)(-30～-40)作為RNA聚合酶的主要結合位點，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；真核基因:

除了含有可與之相對應的CAAT區(qū)之外，大多數(shù)基因還擁有GC區(qū)和增強子區(qū)。TATA區(qū)和其他兩個UPE區(qū)的作用是有所不同的：

TATA區(qū)的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始。如果除去TATA區(qū)或進行堿基突變，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下降的相對值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現(xiàn)所獲得的RNA產(chǎn)物起始點不固定。

研究SV40晚期基因啟動子發(fā)現(xiàn)，上游激活區(qū)(UPE/UAS)的存在與否，對該啟動子的生物活性有著根本性的影響。若將該基因5’上游-21－-47核苷酸序列切除，基因完全不表達。

CAAT區(qū)和GC區(qū)：

主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點的確定。

CAAT區(qū)對轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大：

該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響靶基因的轉(zhuǎn)錄強度。而啟動區(qū)其他序列中一二個堿基的置換則沒有太大的影響。

在TATA區(qū)和相鄰的UPE區(qū)之間插入核苷酸也會使轉(zhuǎn)錄減弱：在人類β-血紅蛋白基因啟動區(qū)的兩個UPE序列之間插入15個核苷酸，該啟動子完全失去功能。

CAAT和GC區(qū)相對于TATA區(qū)的取向(5'－3'或3'－5')，對轉(zhuǎn)錄強度的影響不大。

盡管這3種UPE(GC區(qū)、CAAT區(qū)、TATA區(qū)）序列都有著重要功能，但并不是每個基因的啟動子區(qū)都包含這3種序列。有些基因，如SV40的早期基因，缺少TATA和CAAT區(qū)，只有6個串聯(lián)在上游-30－-110位點的GC區(qū)；組蛋白H2B，不含GC區(qū)，但有兩個CAAT區(qū)，一個TATA區(qū)。真核生物的啟動子特點

（1）有多種元件：TATA框，GC框，CATT框等；（2）結構不恒定。有的有多種框盒,如組蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期轉(zhuǎn)錄蛋白;（3）它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同;（4）有的有遠距離的調(diào)控元件存在，如增強子；（5）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點的作用；（6）不直接和RNApol結合。轉(zhuǎn)錄時先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子相結合，再和聚合酶結合。TATAboxHognessboxpromotergene-50-40-30-20-101105’CAATboxGCbox真核細胞中的部分轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分析三、真核生物轉(zhuǎn)錄的起始

三種RNApol均沒有對啟動子特異序列的識別能力

轉(zhuǎn)錄起始過程需要很多的輔助因子(轉(zhuǎn)錄因子)參與,并且按一定順序與DNA形成復合物,協(xié)助RNApol定位于轉(zhuǎn)錄起始點RNApolⅠTBP因子RNApolⅡ

轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄復合體TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始●真核生物轉(zhuǎn)錄起始復合物Orderofbindingis:IID+IIB+RNApoly.II+IIF+IIE+IIH

RNA聚合酶Ⅱ的啟動子結構主要由4部分組成：1.帽子位點（capsite）：即轉(zhuǎn)錄起始點，以腺嘌呤A起始（非模板鏈），兩側(cè)各有若干個嘧啶。2.TATA框（TATAframe）：又稱為Goldberg-Hogness框(Goldberg-Hognessframe)，或簡稱為Hogness框（Hognessframe）。其一致順序為TATAA(T)AA(T)。TATA框在-25附近，相當于原核的-10序列（pribnowbox）。對大多數(shù)真核生物來說，RNA聚合酶與TATA框牢固結合之后才能開始轉(zhuǎn)錄。3.CAAT框（CAATframe）：位置在-75附近，一致序列為GGC(T)CAATCT。CAAT框可能控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率。4.GC框EnhancersandSilencers

Enhancersstimulatetranscription,silencers inhibit.Bothareorientationindependent.Botharepositionindependent.CanworkatadistancefrompromoterEnhancershavebeenfoundalloverBindregulatedtranscriptionfactors.增強子或強化子（enhancer）：增強子（enhancer）：又稱為遠上游序列（farupstreamsequence)。它是遠距離調(diào)節(jié)啟動子以增加轉(zhuǎn)錄速率的DNA序列，其增強作用與序列的方向無關，與它在基因的上下游位置無關。增強子有強烈的細胞類型選擇，即不同細胞類型，增強作用不同。BindingofActivatorFactorsFinally,high-leveltranscriptionisinducedbythebindingofactivatorfactorstoDNAsequencescalledenhancers.SingleormultiplecopiesineitherorientationUsuallylocatedupstreamCanbeseveralkbfromthegeneSilencerelementsandrepressorfactorsalsoexist該增強子的特點如下：1.對依賴于TATA框的轉(zhuǎn)錄的增強效應高于不依賴的情況2.距離效應；3.轉(zhuǎn)錄方向；4.細胞類型的選擇：不同類型中作用有差異；5.表明其作用具有細胞或組織特異性（調(diào)節(jié)蛋白）；在SV40的轉(zhuǎn)錄單元上發(fā)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)錄起始位點上游約200bp處有兩段72bp長的重復序列，它們不是啟動子的一部分，但能增強或促進轉(zhuǎn)錄的起始，除去這兩段序列會大大降低這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，若保留其中一段或?qū)⒅〕霾逯罝NA分子的任何部位，就能保持基因的正常轉(zhuǎn)錄。除SV40外，還在反轉(zhuǎn)錄病毒基因、免疫球蛋白基因、胰島素基因、胰糜蛋白酶基因等許多基因的啟動區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強子的存在。Anenhancercanactivateapromoterfromupstreamordownstreamlocations,anditssequencecanbeinvertedrelativetothepromoter,

如果把β-珠蛋白基因置于帶有上述72bp序列的DNA分子上，發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平提高了200倍。而且，無論把這段72bp序列放在轉(zhuǎn)錄起點上游1400bp或下游3300bp處，它都有轉(zhuǎn)錄增強作用。增強子很可能通過影響染色質(zhì)DNA-蛋白質(zhì)結構或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結構，從而使得RNA聚合酶更容易與模板DNA相結合，起始基因轉(zhuǎn)錄。

增強子能大大增強啟動子的活性。增強子有別于啟動子處有兩點:[1]增強子對于啟動子的位置不固定，而且能有很大的變動;[2]它能在兩個方向產(chǎn)生作用。一個增強子并不限于促進某一特殊啟動子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一啟動子。各個基因中的增強子順序差別較大，但有一個基本的核心順序(coresequence)：

AAAGGTGTGGGTTTGG

轉(zhuǎn)錄抑制DNA模版抑制劑放線菌素DRNA聚合酶抑制物利福霉素、利迪鏈霉素、α-鵝膏蕈堿

表轉(zhuǎn)錄的抑制劑抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細菌全酶和β亞基結合，抑制起始利迪鏈霉素細菌核心酶和β亞基結合，抑制起始放線菌素D真核PolⅠ和DNA結合，阻止延伸α-鵝膏蕈堿真核PolⅡ和RNAPolⅡ結合真核生物的終止子及轉(zhuǎn)錄終止

了解很少1、RNApolⅡ的終止子類似Prok.不依賴ρ因子終止子，終止可能靠RNApolⅡ本身完成2、RNApolⅢ的終止子類似原核生物（發(fā)夾結構U串）

?U串位于發(fā)夾結構的頂端

?且保守性很強（酵母→人）

?環(huán)和柄對轉(zhuǎn)錄的終止同等重要

基因轉(zhuǎn)錄實際上就是RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結果。四、mRNADifferencesbetweenProkaryotesandeukaryotesProkaryotesmRNAtranscriptismature,anduseddirectlyfortranslationwithoutmodification.Sinceprokaryoteslackanucleus,mRNAalsoistranslatedonribosomesbeforeisistranscribedcompletely(i.e.,transcriptionandtranslationarecoupled).ProkaryotemRNAsarepolycistronic,theycontainaminoacidcodinginformationformorethanonegene.半衰期短5’端無帽子結構，3’端沒有或只有較短的poly（A）結構

原核生物與真核生物mRNA的特征比較信使核糖核酸——mRNA（messengerRNA）。

mRNA在大腸桿菌細胞內(nèi)占總RNA的2％左右；(tRNA占16％，而rRNA則占80％以上)。由于mRNA在細菌細胞內(nèi)的半哀期很短，科學家直到19世紀70年代初才首次從細胞中分離出來?，F(xiàn)已查明，許多基因的mRNA在體內(nèi)還是相當穩(wěn)定的，半衰期從幾個小時到幾天不等。目前，人們已能從幾乎所有生物體內(nèi)分離純化編碼任何蛋白質(zhì)的mRNA。

真核細胞mRNA的最大特點在于它往往以一個較大相對分子質(zhì)量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學修飾的mRNA才能進入細胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細胞mRNA的合成和功能表達發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)。

原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)了。一個原核細胞的mRNA有時可以編碼幾個多肽一個真核細胞的mRNA最多只能編碼一個多肽。原核生物常以AUG，有時GUG甚至UUG作為起始密碼子：而真核生物幾乎永遠以AUG作為起始密碼子。

原核生物mRNA的特征1．原核生物mRNA的半衰期短

細菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開始，核糖體就結合到新生mRNA鏈的5’端，啟動蛋白質(zhì)合成，而此時該mRNA的3’端還遠遠沒有轉(zhuǎn)錄完全。絕大多數(shù)細菌mRNA的半衰期極短，mRNA的降解緊隨著蛋白質(zhì)翻譯過程發(fā)生。轉(zhuǎn)錄開始1min后，降解就開始了，即當一個mRNA的5'端開始降解時，其3'端部分可能仍在合成或被翻譯。

mRNA降解的速度大概只有轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半。每過大約1min，體系中出現(xiàn)新生蛋白質(zhì)的速度就下降50％。

因為基因轉(zhuǎn)錄和多肽鏈延伸的速度基本相同，所以細胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的多少決定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率。大腸桿菌色氨酸合成酶基因平均每分鐘約有15次轉(zhuǎn)錄起始，這些mRNA鏈從生成到降解平均被翻譯10次，所以，穩(wěn)定狀態(tài)下細胞中每分鐘生成150個多肽。新生mRNA與成熟mRNA受核酸酶“攻擊”的概率是相等的。所以，有些mRNA鏈可能被翻譯了許多次，而同一群體中的另外一些mRNA分子可能根本沒有被翻譯；雖然mRNA的壽命具有隨機性，但某一mRNA的翻譯產(chǎn)量卻是大致穩(wěn)定的。

細菌mRNA可以同時編碼不同的蛋白質(zhì)，我們把只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子mRNA(monocistronicmRNA)，把編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子mRNA(polycistronicmRNA)。多順反子mRNA是一組相鄰或相互重疊基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這樣的一組基因可被稱為一個操縱子(operon)，是生物體內(nèi)的重要遺傳單位，如大腸桿菌乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄成編碼3條多肽的多順反子mRNA，經(jīng)過翻譯生成β-半乳糖苷酶、透過酶及乙酰基轉(zhuǎn)移酶。2．許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在幾乎所有mRNA都可以被分成3部分：

編碼區(qū)位于AUG之前的5‘端上游非編碼區(qū)位于終止密碼子之后不翻譯的3’端下游非編碼區(qū)。編碼區(qū)從起始密碼子AUG開始，經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直至終止密碼子。對于第一個順反子來說，一旦mRNA的5'端被合成，翻譯起始位點即可與核糖體相結合，而后面幾個順反子翻譯的起始就會受其上游順反子結構的調(diào)控。

一種情況是，第一個蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結合后才可能開始。

前一個多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基也可能不離開mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結合，啟動第二個多肽的合成。

在噬菌體RNA中，一個順反子的翻譯有時完全取決于它前面順反子的翻譯。因為噬菌體RNA往往形成復雜的二級結構，只有第一個翻譯起始位點是暴露的，在這個順反子翻譯產(chǎn)生多肽的過程中，核糖體的運動破壞了后續(xù)順反子的二級結構，使起始位點較容易與核糖體相結合形成起復合物。