武漢長江工商學(xué)院生物制藥工程技術(shù)論文院：環(huán)境與生命科學(xué)系專業(yè)：生物工程年級：10412班題目:大孔樹脂純化魚腥草總黃酮解析工藝研究學(xué)生：黃婉星 學(xué)號：1004011221指導(dǎo)教師：楊文婷職稱:2013年4月15日目錄TOC\o"1-2"\h\u4606摘要 36321關(guān)鍵詞 311633Abstract 319673Keywords 33355前言 427081.儀器與試劑 4190331.1儀器 4188601.2試劑 467222.方法與步驟 4239362.1大孔樹脂的預(yù)處理 4211762.2魚腥草總黃酮上柱樣品液的制備 4236532.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 4206872.4洗脫劑的選擇 558682.5水洗量的考察 549862.6乙醇洗脫濃度的考察 5180042.7洗脫流速的考察 6134772.8洗脫劑用量的考察 650603.結(jié)果與分析 731782參考文獻(xiàn) 8AB-8大孔樹脂純化魚腥草總黃酮解析工藝研究摘要：文章對魚腥草中總黃酮提取工藝進(jìn)行研究，查文獻(xiàn)得出較好的一種提取方法，然后用AB-8大孔樹脂作為分離材料對魚腥草中總黃酮進(jìn)行分離，并對大孔樹脂分離總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括水洗量的考察、乙醇洗脫濃度的考察、洗脫流速的考察、洗脫劑用量的考察等。關(guān)鍵詞：魚腥草；總黃酮；AB-8大孔樹脂；提取StudyOnTheExtractTechnologyofTotalFlavonoidinHorttuyiaCordalaThunbUsingAB-8MacroreticularAdsorptiveAbstract:Theextracttechnologyoftotalflavonoidinhorttuyiacoadalathumbwerestudied.Agoodmethodwasobtainef;thenAB-8macroreticularwasusedasadsorptiveresinstoseparatetotalflavonoidinhorttuyiacoadalathumb.TheoptimumcraftparametersofusingAB-8macroreticularadsorptiveresinstotalflavonoid.Includingwashingconcentration、washingrate、throughwashingcurve,theresincanusetimesrepeatedly.Keywords:horttuyiacoadalathumb；totalflavonoid；AB-8macroreticular；extract前言魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)，又名蕺菜。別名丑菜，側(cè)耳根，豬鼻孔，臭根草。列于《名醫(yī)別錄》下品，是味較常見的中草藥，廣泛分布于長江以南各省，是一種很好的天然保健食品原料[1]。其味辛，性微寒，歸肺經(jīng)，其功能有清熱解毒，消癰排膿，利尿通淋，用于肺癰吐膿，痰熱喘咳[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明[3-6]：魚腥草有抗病毒、抗菌、解熱、抗炎鎮(zhèn)痛、升白細(xì)胞等作用。近年來魚腥草有了新的用途,如:用來治療喘息型肺炎、病毒性心肌炎、小兒呼吸感染等[7-8]。魚腥草的主要化學(xué)成分有癸酰乙醛（也叫魚腥草素）、月桂醛、2十烷酮、甲基正壬基酮、癸醛、亞油酸及大量的黃酮類化合物[2-9]。黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分。在自然界中最常見的是黃酮和黃酮醇，其它包括雙氫黃（醇）、異黃酮、雙黃酮、黃烷醇、查爾酮、橙酮、花色苷及新黃酮類等[10-14]。天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，能通過血腦屏障，能進(jìn)入脂肪組織，進(jìn)而體現(xiàn)出如下功能：消除疲勞、保護(hù)血管、防動脈硬化、擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大腦及其他臟器細(xì)胞的功能[14-15]。黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用。近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點倍受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目[16-18]。本文實驗結(jié)果表明，魚腥草中含有較為豐富的黃酮。因此，魚腥草具有廣泛開發(fā)和利用價值。1.儀器與試劑1.1儀器AB-8大孔吸附樹脂，真空干燥箱，層析柱，UV755B紫外可見分光光度計，高速離心機(jī)，稱量天平1.2試劑95%乙醇；亞硝酸鈉AR；硝酸鋁AR；氫氧化鈉AR；萘酚試液AR，濃硫酸AR，市售新鮮魚腥草2.方法與步驟2.1大孔樹脂的預(yù)處理取20gAB-8型大孔樹脂，用蒸餾水反復(fù)清洗干凈后，加入95%乙醇浸泡24h，充分溶脹，濕法裝柱。然后用95%乙醇以2倍柱體積/h（即1ml/min）的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色渾濁為止，以去除樹脂中所含有的低聚物、添加劑等雜質(zhì)，再用蒸餾水以同樣流速淋洗，至水洗脫液無乙醇味，用水浸泡備用。2.2魚腥草總黃酮上柱樣品液的制備取魚腥草干品粗粉2g，根據(jù)查閱文獻(xiàn)選出的魚腥草總黃酮的乙醇浸提最優(yōu)水平組合工藝：即采用70%乙醇、20℃溫度浸泡30min、微波30s進(jìn)行提取制備，制得魚腥草總黃酮提取液冷藏備用，同時測得魚腥草總黃酮提取液吸光度0.248，由標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出魚腥草總黃酮提取液中總黃酮含量為0.5856mg.mL-1。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制先制備0.2mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液各0，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，置于25ml容量瓶中，各加水6.0ml，5.0ml，4.0ml，3.0ml，2.0ml，1.0ml再加入0.7mol/L亞硝酸鈉溶液1.0ml，搖勻，靜置6min；再加0.5mol/L硝酸鋁溶液1.0ml，搖勻，靜置6min；再加1.0mol/L氫氧化鈉溶液10.0ml，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15min，以1號作空白，于500nm波長處測吸光度。結(jié)果見表1。表1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/ml）00.0080.0160.0240.0320.040.048吸光度值00.1030.1860.2540.3770.4210.503圖一蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線2.4洗脫劑的選擇化合物經(jīng)樹脂吸附后，根據(jù)吸附力強(qiáng)弱不同而選用不同的洗脫劑。一般來說，非極性大孔樹脂，洗脫極性越小，洗脫能力越強(qiáng)；對于中性大孔樹脂和極性較大的化合物，則用極性較大的溶劑。有根據(jù)黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，但考慮到甲醇的毒性和丙酮的毒性、揮發(fā)性，故本實驗采用乙醇作為洗脫劑，用原料95%的乙醇配成不同濃度的乙醇溶液留待備用。2.5水洗量的考察取魚腥草提取液10ml，加于20g大孔樹脂上，吸附流速為2倍柱體積/h（即1ml/min）,然后水洗，每10ml接取水流出液，用Molish反應(yīng)（取水洗液1ml，加5%萘酚試液數(shù)滴，震蕩，然后沿管壁加入5-6滴濃硫酸，使其分層，待2-3min后，兩層液面檢出現(xiàn)紫紅色環(huán)）檢測洗脫終點，檢測結(jié)果顯示前4管溶液中含有洗脫下來的總黃酮，將這四管水洗液置于培養(yǎng)皿中于真空干燥箱中干燥，冷卻30min后，迅速精密稱量干膏重。結(jié)果見表2。表2水洗液中總黃酮含量器皿重（g）26.420431.264731.119435.8504烘干后總重（g）26.423631.338731.127435.8104100ml洗脫液干膏重（g）0.00320.0740.0080.0052.6乙醇洗脫濃度的考察取魚腥草提取液10ml，共6分，分別加于20g大孔樹脂上，吸附流速為2倍柱體積/h（即1ml/min）,再以2倍柱體積/h的水洗脫，棄去水洗液，再分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脫，分別收集乙醇洗脫液至100ml，測定吸光度，計算總黃酮含量和解析率。精密吸取收集的乙醇洗脫液25ml，干燥后迅速精密稱量干膏重。結(jié)果見表3。表3不同濃度乙醇洗脫液中總黃酮含量乙醇濃度（%）405060708090吸光度值0.0030.0050.0090.0130.0120.014總黃酮含量（mg）0.772.843.31解吸率（%）12.1320.5138.1452.4248.5059.26100ml洗脫液干膏重（g）0.030.0740.17040.33960.25400.33882.7洗脫流速的考察取魚腥草提取液10ml，共4份，分別加于20g大孔樹脂上，吸附流速為2倍柱體積/h（即1ml/min）,再以2倍柱體積/h的水洗脫，棄去水洗液，將飽和吸附的樹脂用上述選取的最適乙醇洗脫濃度（即70%乙醇）以不同的洗脫流速進(jìn)行洗脫，初步設(shè)定為1ml/min、3ml/min、5ml/min，分別收集洗脫液至100ml，測定吸光度，計算總黃酮含量和解析率。精密吸取收集的乙醇洗脫液25ml，干燥后迅速精密稱量干膏重，計算干膏中總黃酮含量。結(jié)果見表4。表4不同流速洗脫液中總黃酮含量洗脫流速（ml/min）135吸光度值0.0130.0120.011總黃酮含量（mg）3.072.842.60解吸率（%）52.4248.5044.40100ml洗脫液干膏重（g）0.33960.24120.23362.8洗脫劑用量的考察取魚腥草提取液10ml，加于20g大孔樹脂上，吸附流速為2倍柱體積/h（即1ml/min）,再以2倍柱體積/h的水洗脫，棄去水洗液，將飽和吸附的樹脂用上述選取的最佳乙醇洗脫濃度（即70%乙醇）以最佳洗脫流速（即1ml/min）進(jìn)行洗脫，每10ml洗脫液收集1份，測定吸光度，繪制洗脫曲線。結(jié)果見表5。表5洗脫曲線洗脫流份123456吸光度值0.0010.0100.0320.0110.0040.001總黃酮含量（mg）0.242.367.562.600.950.24解吸率（%）4.1040.3087.9731.1911.052.79圖二70%乙醇洗脫曲線3.結(jié)果與分析本實驗對魚腥草中總黃酮提取工藝進(jìn)行了研究，首先查閱相關(guān)的文獻(xiàn)，選用AB-8型樹脂作為分離純化魚腥草總黃酮用樹脂。70%乙醇為洗脫劑，用于魚腥草總黃酮的動態(tài)吸附-洗脫，然后對大孔樹脂分離總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行了選擇：包括水洗量的考察，洗脫劑的選擇，洗脫濃度的選擇，洗脫流速的選擇，洗脫劑用量的考察，洗脫曲線的考察等。由表2可知，吸附后用水沖洗對已吸附的總黃酮會有一定量的損失，水洗次數(shù)越多，損失量越大，水洗4次損失吸附量的15.4%，不過水洗可以除去部分雜質(zhì)，提高樹脂中剩余吸附的總黃酮濃度，從而提高解析下來的總黃酮含量?？傮w來說還是利大于弊，故在后續(xù)實驗中有必要均先水洗后再開始通入乙醇進(jìn)行解析。由表3可知，隨著洗脫劑乙醇濃度的增高，吸光度及洗脫率都逐漸增大，70%～90%的乙醇洗脫率幾乎均在50%以上，而解吸率越高，則洗脫下來的總黃酮含量越高?？紤]到節(jié)約成本及生產(chǎn)安全上的方便，本實驗選用70%乙醇為其他后續(xù)實驗的洗脫劑。由表4可知，在確定了洗脫的其他最佳條件時，如上樣量，洗脫濃度等，乙醇洗脫流速越快，解吸率越高，若洗脫流速過快，樹脂還未來得及吸附，黃酮類化合物已經(jīng)隨洗脫液流出層析柱；而洗脫流速過慢又存在耗時，大工業(yè)生產(chǎn)時增加生產(chǎn)成本的缺點。故洗脫流速應(yīng)首先保證大部分的黃酮類化合物能基本洗脫下來的情況下，洗脫流速越快越好。本實驗選取1ml/min為最佳。由表5可知，總黃酮洗脫量主要集中在第2、3、4三次，占總黃酮洗脫量的89.74%。此時洗脫劑的用量為3倍樹脂體積。由洗脫曲線可知故洗脫劑用量的考察一般在50ml左右即可。對AB-8大孔樹脂分離總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行選擇結(jié)果：洗脫濃度采用70%乙醇，洗脫流速為1ml/min，洗脫曲線的考察表明用50ml左右的洗脫劑洗脫即可。不過，隨著吸附-洗脫次數(shù)的增加，殘留在樹脂上而不能被洗脫下來的雜質(zhì)會增加，會堵塞樹脂通道，或使某些官能團(tuán)失去吸附性能，即毒化樹脂，使樹脂的吸附力減弱或喪失，總黃酮吸附率，純度等均呈下降趨勢。因此使用一段時間后（4-5），必須對樹脂進(jìn)行再生處理，以保證總黃酮回收率在80%以上，純度在80%以上。一般來說，對于AB-8大孔樹脂，連續(xù)使用3次后總黃酮解吸率會明顯下降，三次以后就需對樹脂進(jìn)行再生處理。本次試驗的結(jié)果雖有些和參考數(shù)據(jù)有出入，不過大體上還是能達(dá)到出本次試驗的目的，能夠篩選出AB-8大孔樹脂分離總黃酮的最佳工藝參數(shù)。產(chǎn)生最大誤差之處有兩點：1.配置魚腥草提取液時沒有考慮到參考文獻(xiàn)與實際試劑和儀器間的差別，故配成的魚腥草提取液濃度偏低，導(dǎo)致洗脫后的濃度也不高，吸光度越低，解吸率就越低，故使準(zhǔn)確率有一定的降低。2.AB-8大孔樹脂在使用3次以后沒有及時進(jìn)行再生處理，使總黃酮的解吸率也有下降，導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不精確。此外，還有些環(huán)境因素如早晚溫差、儀器因素如層析柱嚴(yán)密性不夠易產(chǎn)生氣泡和流速不易掌控等也會導(dǎo)致實驗的成功率下降。經(jīng)過這次試驗，我不僅對魚腥草的成分、功能等方面有了一定的了解，同時也基本掌握了AB-8大孔樹脂提取分離魚腥草總黃酮的要點和方法以及有關(guān)的計算，此外，還學(xué)會了對各種常見溶液的配置，增加了對一些常見儀器的使用熟練度等。在以后類似的試驗中，我一定盡量改進(jìn)不足之處，使實驗結(jié)果盡可能精確，讓實驗更成功。參考文獻(xiàn)［1］張豐強(qiáng).臨床大本草［M］.北京：華夏出版社，2002：877.［2］游見明，劉達(dá)玉.魚腥草黃酮提取工藝研究［J］.食品研究與開發(fā),2004，25（6）：55.［3］李文，王少軍.魚腥草提取液抗流感、腮腺炎病毒效果觀察［J］.預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，1999，5(4)：377.［4］侯曉梅，曾慶源，沈英才.魚腥草治療帶狀皰疹的療效觀察［J］.社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2005，3(5):83.［5］陳衛(wèi)兵，姜彩娥，熊南燕，等.魚腥草對青霉素和頭孢唑林