載體的類型和載體元件的解 by通過工程送到受體細(xì)胞時(shí)，需要運(yùn)載工具攜帶外源進(jìn)入受體細(xì)因轉(zhuǎn)移載體。在將外源插入載體后，攜帶外源的載體被包裝成顆粒就構(gòu)成了導(dǎo)入系統(tǒng)。載體除了能攜帶外源并能被包裝成病會增殖和。非載非載體一般是指質(zhì)粒桿菌)中，使重組體中的目標(biāo)在受體細(xì)胞中得以繁殖或表達(dá)，從而改變寄主具有克隆載體的基本元件（起始位點(diǎn)Ori，多克隆位點(diǎn)MCS等），可以攜帶DN段或外源進(jìn)入受體細(xì)胞并大量擴(kuò)增DN段（外源）的載一 即控 制起始位點(diǎn)。慢、逆轉(zhuǎn)錄、腺都只有1個(gè)起點(diǎn)。二、抗生素抗性Ampr：2青霉素抗性，能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性Kanr：卡那霉素抗性，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，能使卡那霉素失活Puro：嘌呤霉素抗性，可使用puromycin篩選帶有Puro標(biāo)記的細(xì)胞Neo：新霉素抗性，可使用G418或Neomycin篩選帶有Neo標(biāo)記的細(xì)胞。Hygr：潮霉素抗性，可使潮霉素β失表達(dá)Shble的細(xì)胞Blasticidin：殺稻瘟菌素抗性。殺稻瘟菌素通過干擾核糖體中肽鍵的形 決定能不能放目的以及如何放置目的，還要再看外源DNA插入片 EF1a啟動子啟動目及其后面的His補(bǔ)充材料 EF1a啟動子啟動目及其后面的His補(bǔ)充材料 5MV啟動子啟動GFP及之后通過2A非融合的uro。2A為一種可自我剪2個(gè)氨基酸從而實(shí)現(xiàn)2IR不過它實(shí)現(xiàn)非融合表達(dá)的方式與2WPR（能加強(qiáng)轉(zhuǎn)的表達(dá)ψ包裝信號和LTR長末端重復(fù)序列為第三代慢載體中的來自HIV-1 表達(dá)載體中是否要加及的類型和選擇 首先大家需要對蛋白的概念有所了解，蛋白（proteintag）是指與His-tag（組氨酸蛋白純化首白的C末端或N末端，可以使用鎳柱對帶Histag的重組蛋白進(jìn)行純化。蛋白純化完之后可以不需切除此，也不會對蛋白產(chǎn)生功能影響免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進(jìn)行免疫并抗體可以和其它的親和一起構(gòu)建雙親和Streptag和改進(jìn)型StrepNusA蛋白是文獻(xiàn)在大腸桿菌中促進(jìn)外源蛋白表達(dá)能力最強(qiáng)的蛋白之一。NusA不具有獨(dú)立的純化功能，所以要與其它(如His)聯(lián)用。提高不溶性靶蛋白如牛生長激素（bGH)、人干擾素-γhIFN-γ)的可溶性。NusASUMO（小泛素相關(guān)修飾物）SUMO蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Smallubiquitin-likemodifier白的表達(dá)，且能促進(jìn)外源蛋白可溶表達(dá)。FkpA類蛋白，F(xiàn)kpA為大腸桿菌肽GST-Tag（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶Gg相對分子質(zhì)量較大，約為2ka，插入在目的蛋白的C末端或N末端，大腸桿菌中常用在端。一般選擇GT的目的有兩個(gè)，一是提高蛋白表達(dá)的可溶性，二是提高蛋白的表達(dá)量。GTT在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真白。MBP的折疊需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES兩個(gè)分子伴侶系統(tǒng)的（DYKDDDDK易于用Anti-Flag的抗體進(jìn)行檢測白質(zhì)中仍可識別其相應(yīng)抗體。c-MyctagWestern-blot雜交技術(shù)、HA蛋白，序列為YPYDVPDYA的9個(gè)氨基酸殘基多肽，源于流感簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA的抗體進(jìn)行檢測AviTag蛋白是一個(gè)15個(gè)氨基酸殘基組成的短肽，具有一個(gè)單生物素化用于蛋白質(zhì)相互作用研究。AviTag系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點(diǎn)：無論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個(gè)獨(dú)特的AviTag位點(diǎn)輕生物素與鏈親和素具有很高的很專一的結(jié)合活性，非常便于后期檢測司合作來完成哦，很多公司都承諾不成功不的。最后，祝大家實(shí)驗(yàn)順利！ 過表達(dá)與下調(diào)表達(dá) 載體構(gòu) 一 克隆構(gòu)建方下調(diào)表達(dá)方法有：過表達(dá)micorRNA成熟體互補(bǔ)序列（簡單、直接、有PUROpA2pD.GpMDL，VSVG，REVmiRNA過表達(dá)（過表達(dá)側(cè)翼序列獲得miRNA側(cè)翼序列下圖紅色箭頭指示處,選擇物種，輸入想要搜索的microRNA，這里以人點(diǎn)擊下圖箭頭所指，獲得mir21在上的位置補(bǔ)充材料補(bǔ)充材料 此處強(qiáng)烈強(qiáng)烈不建議點(diǎn)擊箭頭1處，點(diǎn)擊之后會提示“centerhere”，容易補(bǔ)充材料 點(diǎn)擊Next，再選擇輸出格式，建議保存成text格式，備份一下獲得pre-miRNA序列如下。直接粘貼到oligo等軟件中進(jìn)行引物設(shè)計(jì)即可設(shè)計(jì)引物引物長度建議長一些，我用的是24bp左右，特異性較好，引物長度如下上游序列取pre-miR上游序列100-300bp，下游取pre-miR下游序列100-提取組DNA作為PCR模建議使用組DNA提取試劑盒，國產(chǎn)的就夠用，如天根DP304、索來D1700、福際DE-05011目的片段plus。也有用康潤生物的A052A062，是PCRMIX，可以直接用。直接過表達(dá)microRNA成熟體實(shí)現(xiàn)microRNA過表達(dá)也是可靠的。如以下游R：5`-AATTCAAAAAAACCCCTATCACGATTAGCATTAA-microRNAAntago法下調(diào)microRNA表達(dá)過，無建議?？蓞⒖技夹g(shù)文獻(xiàn)：MicroRNAsponges:competitiveinhibitorsofsmallRNAsinmammaliancells.PMID: 插入片段的合成按引物合成的方法即可，首選生工生物工程()有限公司http /，也可選擎科新業(yè)生物技術(shù)。則在西安有合成部及部，合成及送均方便，因此多用擎科。PCR儀中進(jìn)行退火程序：存-酶切PCR 單酶切雙酶切酶切條件酶切應(yīng)用酶切質(zhì)粒，構(gòu)建粘性末構(gòu)建好單克隆，質(zhì)粒鑒定時(shí)，也需要雙酶切瓊脂糖凝膠電泳及回收DN所需儀器和試劑電泳儀：國貨如君意牌的電泳儀電源及電泳槽。Agarose步驟配膠常用1%瓊脂糖凝膠，即1g瓊脂糖粉配到100ml1×TAE中，微波爐，高火，電壓選擇：若要分離的好，電壓不要太高，4V/cmLoadingbuffer有顏色指示，但是那不是條帶位置，僅能做大致判斷。自已膠回收用的試劑盒，按說明書操作即可材料：T4DNA連接酶，T4DNA連接酶buffer，無菌雙蒸水，測好濃度連接體系和連接條件連接體系按連接酶說明書配制（通常10μl連接體系中T4DNA連接酶加1μl，10×buffer加1μl，酶切載體片段與目的片段的摩爾比例，個(gè)人建議以1:5-轉(zhuǎn)步驟一（適合連接產(chǎn)物冰浴加100μl無抗LB，37℃，200rpm搖1小時(shí)步驟二（適合新買或新獲贈質(zhì)粒42℃熱激90s，再冰浴加入900μl無抗的LB液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm震蕩培養(yǎng)鋪LB平板、也稱倒板子配LB瓊脂，有配方，但是建議直接買預(yù)混好的，按說明書配，如百思的倒入LB瓊脂的板子，放平，冷卻，待LB瓊脂凝固，保鮮膜包裹，存放4鋪精燈上燒一下，空中自然晾涼。還可以選用涂布棒。41℃時(shí)，實(shí)測溫度才37方法一：酶切鑒，菌落/菌液菌液PCR也是利用菌體高溫裂解釋放出的DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)，與菌落很多老師使用菌落/菌液PCR，因?yàn)榧訇栃月视悬c(diǎn)高。據(jù)老師說，假陽PCR體系PCR國貨即可，如天根的引物引物PCR程序95℃，15min，時(shí)間短的話，可能解鏈95℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，2572℃，7min，暫存4℃或電PCR完畢，瓊脂糖凝膠電泳判定片段大小，如下圖所示十一個(gè)陽性條帶，十個(gè)正確方法三：組質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)是正確。 大腸桿菌常用培養(yǎng)基：LB個(gè)人建議PCR這前搖了2小時(shí)的菌液放到4℃，待晚上離開前，再加LB培養(yǎng)基慢包裝（以PLKO.1-PURO體系為例pMD2.（段的PLKO.1-PURO（無內(nèi)毒素，HEK-293Tcells，OPTI-MEM?serum-freemedia，轉(zhuǎn)染試劑lipofectmin2000。步驟（以60mm圓皿為例轉(zhuǎn)染前一天，在60mm圓皿中接種HEK-293T細(xì)胞37℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)（盡量下午或晚上轉(zhuǎn)染PLKO.1-PURO無內(nèi)毒素質(zhì)4psPAX23pMD2.G1OPTI-補(bǔ)充至預(yù)混LIPO2000：LIPO200020μl加OPTI-MEM至500μl轉(zhuǎn)染次轉(zhuǎn)染8-12h后更換完全培養(yǎng)基，可恢復(fù)雙抗，37℃，5%CO2培養(yǎng)24h轉(zhuǎn)染第二收集培養(yǎng)基上清，即可得到慢顆粒，1200rpm離心5min，去除混雜293T細(xì)胞，存-80轉(zhuǎn)染第三再次收集培養(yǎng)基上清，也可得到慢顆粒，1200rpm離心5min，去除混滴度測定及MOI測定濃縮TA克 by貓A克隆是將CR片段與3’末端具有突出的T的載體片段連接起來的克隆方法。由于aq酶有末端連接酶的功能，使用aq酶進(jìn)行得到的產(chǎn)物其3末端具有突出的A，這個(gè)突出的A剛好跟載體片段上突出的T互補(bǔ)配對，從而使用T4連接酶能將個(gè)段給連接起來。我常用的T載體是Promega公司的pGEM-Teasy，下面以這個(gè)T載體為pGEM-TEasyVector是經(jīng)過特殊處理的線性化的載體片段，其兩端各分就是pGEM-TEasyVector上突出的T，在倆T之間可以插入兩端帶A的目酸談補(bǔ)充材料 pGEM-TEasyVector上有很多元件，這些元件在不同的實(shí)驗(yàn)中可能會發(fā)揮的時(shí)候可以作為一個(gè)中間過渡載體來用，有T7TranscriptionStart位點(diǎn)和SP6TranscriptionStart位點(diǎn)，可以用于做體外轉(zhuǎn)錄模板。通常，我是將pGEM-TEasyVector作為中間過渡載體來用的。因?yàn)橛行r(shí)下來回收先TA克隆一下，看哪個(gè)是對的；甚至有的時(shí)候PCR反應(yīng)不特異得片涂抹狀的條帶中位置跟目標(biāo)條帶大小差不多的地方切膠下來回收，做TA克隆，效率低，加了保護(hù)堿基也還是很低，如果直接切PCR片段，可能酶切不完全，最到的片段兩端是平的，這樣得到的PCR片段沒法直接做TA克隆，那么怎么辦呢？72℃保溫半小時(shí)；第二種是在釣時(shí)就在PCR體系中加一點(diǎn)taq酶。我一般采2×RapidLigationBuffer 5μlT4DNALigase（3Weissunits/μl）1μl切膠回收的PCRproduct xμlpGEM-TEasyVector 7-x混勻后室溫×1h，或16℃×4h，或4℃×overnight這個(gè)連接體系用的是pGEM-TEasyVector盒子里自帶的酶和buffer，這個(gè)×bufferPCR片段只能加一點(diǎn)點(diǎn)，如果PCR產(chǎn)物量少了，可能會造成后續(xù)挑克隆，完全可以用帶10×buffer的T4DNALigase盒子來配連接體無縫克 by貓Cloning克隆可以實(shí)現(xiàn)一次拼接多個(gè)片段（傳統(tǒng)的酶切連接法拼接3個(gè)片段的效率就已經(jīng)原理。先看來自Gibson的09年NatureMethodspaper里的原理圖：酸談補(bǔ)充材料 部分堿基順序是一模一樣的，這