依賴的細(xì)胞內(nèi)的抗體中和反應(yīng)先看一道試題：2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）是新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）的致病因子，是引起全球大流行的原因。安全、有效且可快速部署的疫苗是全球控制疫情傳播的有效措施。中和抗體能夠反映疫苗的有效性。病毒中和抗體的主要作用是()。A、阻止病毒吸附B、抑制病毒基因表達(dá)C、干擾病毒蛋白的合成D、阻止病毒裝配和釋放答案：A這道試題提到了“中和抗體”。那么，什么是中和抗體？原理是什么？抗體是免疫系統(tǒng)在抗原的刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶B細(xì)胞增殖分化而成的漿細(xì)胞產(chǎn)生的可以與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白.傳統(tǒng)意義上認(rèn)為抗體可以通過其可變區(qū)（V區(qū)）與病毒的特異性表位高度親和，包被病毒粒子，阻斷病原體吸附、侵入細(xì)胞進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)機(jī)體免受病原體侵害的中和作用。此外，抗體還可以與抗原形成復(fù)合物后通過其Fc段與表達(dá)Fc受體（FcR）的免疫細(xì)胞結(jié)合,發(fā)揮不同的免疫功能。如抗體依賴的調(diào)理作用以及抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒（ADCC）作用。過去認(rèn)為,抗體的抗病毒作用僅限定在細(xì)胞外，當(dāng)病毒侵入細(xì)胞后，抗體就失去了防御病毒感染的功能。然而，最近的研究表明抗體可以通過招募三基序蛋白21（TRIM21），將病毒-抗體二元復(fù)合物靶向蛋白酶體進(jìn)而將病毒清除,這在免疫學(xué)上被稱為TRIM21介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞內(nèi)中和反應(yīng)（ADIN）。1.TRIM21蛋白結(jié)構(gòu)TRIM21是由干擾素誘導(dǎo)的TRIM蛋白，又名Ro52/SS-A,早期作為干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病的抗原被廣泛研究。人源TRIM21蛋白分子量為52kD，由位于氨基端的RING-finger結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域及羧基端的PRY-SPRY結(jié)構(gòu)域組成。RING結(jié)構(gòu)域含有E3泛素連接酶活性，用于轉(zhuǎn)移與E2泛素結(jié)合酶結(jié)合的泛素分子。該結(jié)構(gòu)域中保守的半胱氨酸和組氨酸殘基與兩個鋅離子形成結(jié)合位點(diǎn)，用于維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu).B-box結(jié)構(gòu)域包含一個由$螺旋及三個"折疊股組成的核心結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)采取PP?P的折疊方式,通過與鋅離子結(jié)合穩(wěn)定蛋白的空間構(gòu)象。B-bo：可以占據(jù)RING結(jié)構(gòu)域中的E2泛素結(jié)合酶位點(diǎn)，從而阻斷E2與TRIM21的結(jié)合，調(diào)節(jié)TRIM21的泛素化活性。Coiled-coil結(jié)構(gòu)域是由多個$螺旋相互纏繞而成的超螺旋結(jié)構(gòu)，具有七殘基及十一殘基重復(fù)序列,可促進(jìn)TRIM21形成同源二聚體或者與其他TRIM蛋白形成異源二聚體。Coiled-coil結(jié)構(gòu)域也可以參與對底物的識別與泛素化過程。TRIM21的PRY-SPRY結(jié)構(gòu)域由PRY及SPRY兩個子結(jié)構(gòu)域組成，分別含有約60和150個氨基酸殘基。晶體結(jié)構(gòu)分析表明,PRY-SPRY是一個球狀三維折疊結(jié)構(gòu)，內(nèi)含一個由兩個反向平行的"折疊片組成的扭曲的"-三明治結(jié)構(gòu)。PRY-SPRY包含2個由6個可變的loop環(huán)形成的結(jié)合“口袋”，這兩個口袋分別位于PRY及SPRY子結(jié)構(gòu)域,用于結(jié)合抗體Fo段的CH2%CH3區(qū)域.2.抗體依賴的細(xì)胞內(nèi)中和反應(yīng)病毒中和反應(yīng)是抗體阻斷病毒感染細(xì)胞的一種重要機(jī)制。過去認(rèn)為，病毒中和反應(yīng)只發(fā)生在細(xì)胞外且不需要其他效應(yīng)分子的參與。用于解釋中和作用的occupancy模型認(rèn)為封閉病毒粒子抗原表位的抗體達(dá)到一定的閾值以后，才能阻斷病毒侵入細(xì)胞發(fā)揮中和作用.然而此模型卻不能解釋為什么單個中和抗體就可以失活病毒粒子的現(xiàn)象，直到基于TRIM21介導(dǎo)的ADIN被發(fā)現(xiàn)后才使得人們對中和作用機(jī)制的認(rèn)識更加全面.2.1病毒通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞病毒-抗體二元復(fù)合物與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的激酶信號通路。復(fù)合物經(jīng)內(nèi)化，膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)后與胞內(nèi)體融合，借助胞內(nèi)體的酸性pH環(huán)境發(fā)生構(gòu)象改變，然后裂解并穿透胞內(nèi)體的膜囊進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。研究顯示，并非所有的抗體都可以結(jié)合著病毒進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中。例如,在包膜病毒的膜囊與細(xì)胞質(zhì)膜融合，釋放病毒進(jìn)入胞內(nèi)體的過程中，抗體會與病毒分離，被阻斷在細(xì)胞外。此外，某些非包膜病毒（如鼻病毒HRV2），在感染細(xì)胞時會將基因組由胞內(nèi)體的膜孔釋放入細(xì)胞質(zhì)中,由于膜孔的孔徑太小，抗體不能與基因組一起進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中.2.2病毒-抗體復(fù)合物與TRIM21蛋白的結(jié)合TRIM21在溶液中通過Coiled-coil結(jié)構(gòu)域組裝成同源二聚體，當(dāng)病毒-抗體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,TRIM21的PRY-SPRY會與抗體的Fo段形成疏水性結(jié)合口袋，PRY、SPRY兩個子結(jié)構(gòu)域各結(jié)合于Fo段的CH2CH3區(qū)域,二聚體與抗體的結(jié)合比例為1:1.研究表明，氨基酸H433fo,N434fo以及H435”。為抗體Fc段的“熱點(diǎn)殘基”，H433F，N434F可以與位于TRIM21SPRY結(jié)構(gòu)域的D355spry形成氫鍵，而H35”可以與D452SPry以氫鍵形式結(jié)合。此外，位于Fc段CH2區(qū)的1253^還可以與PRY的W299Pry形成氫鍵，如果將H433f、N434f、H435f分別單點(diǎn)突變?yōu)楸彼?，抗體阻斷病毒感染的能力就會減弱。同樣的，氨基酸D355、W381、W383及F450為TRIM21中的“熱點(diǎn)殘基”，可以與Fc段的H433f、N434f、H435f形成結(jié)合界面,4個殘基中的任何一個突變后都會影響與Fc段的結(jié)合能力哺乳動物的TRIM21與抗體IgG的結(jié)合具有高度的保守性及跨種反應(yīng)性，人源及鼠源TRIM21可以與多種不同哺乳動物的IgG抗體結(jié)合，而且親和力幾乎相同。實驗數(shù)據(jù)表明，pH不會對TRIM21與抗體的結(jié)合產(chǎn)生顯著的影響，而鹽離子濃度由200nM降至20nM后,TRIM21與抗體的親和力提高了5倍，表明鹽離子濃度會影響TRIM21與抗體IgG的結(jié)合能力。除可以與抗體IgG結(jié)合外，TRIM21還可與IgM、IgA結(jié)合,然而與IgM、CA的結(jié)合能力遠(yuǎn)低于與IgG抗體的結(jié)合力。位于IgG抗體Fc段的H433f、N434f。、H435fc分別對應(yīng)于gM中的H433”、234”、R435fc及IgA中的P440f、441、A442f，不同抗體亞型Fc段氨基酸序列的差異性可能是造成與TRIM21單體不同親和能力的重要因素。2.3TRIM21的自身泛素化當(dāng)TRIM21與病毒-抗體復(fù)合物結(jié)合形成病毒-抗體-TRIM21三元復(fù)合物以后，就會激活其RICG結(jié)構(gòu)域中E3泛素連接酶的活性,活化的TRIM21會發(fā)生自身泛素化。這個過程需要在E2泛素結(jié)合酶Ube2W及Ube2N/Ube2V1的共同參與下完成。體外實驗表明，Ube2W在對TRIM21單點(diǎn)泛素化以后，可以將Ube2N/Ube2V1促進(jìn)形成的K63多聚泛素鏈偶聯(lián)至TRIM21上。同樣的，體內(nèi)實驗表明Ube2W與Ube2N對于形成K48或K63位多聚泛素鏈與TRIM21的偶聯(lián)也是必不可少的。2.4中和作用及信號通路的激活三元復(fù)合物需要在去泛素化酶Poh1的作用下釋放K63多聚泛素鏈以后才能被轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白酶體的核心顆粒（CP）中水解。然而，病毒復(fù)合物的粒徑往往大于蛋白酶體孔的直徑。例如，腺病毒的粒徑在100nm左右，而蛋白酶體孔的直徑約為2nm，這就增加了病毒進(jìn)入蛋白酶體的難度。因此，降解過程需要AAAATPasep97/VCP的參與，VCP的ATP酶活性將病毒去組裝或者解折疊后再將其轉(zhuǎn)運(yùn)至蛋白酶體。降低VCP的表達(dá)或者抑制VCP的ATP酶活性都會消除抗體對AdV的中和作用。病毒在VCP及蛋白酶體的共同作用下脫去核衣殼，暴露出基因組并與核酸結(jié)合受體RIG-1（識別RNA）或cGAS（識別DNA）結(jié)合，激活PAMP依賴的免疫信號通路。游離的K63多聚泛素鏈則激活NF-kB、AP-1、IRF-3、IRF-5及IRF-7信號通路進(jìn)而促進(jìn)IL-6、CCL4、TNF、GN等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，輔助機(jī)體抵抗病原體的感染。2.5對ADIG敏感的病原體類型研究表明，ADIG是一種高效的中和作用機(jī)制。例如，用ICN刺激MEF細(xì)胞誘導(dǎo)TRIM21高效表達(dá)后，僅需1.6倍的抗體量就可以中和腺病毒的感染。目前認(rèn)為,非包膜病毒是ADIG的主要對象。例如，口蹄疫病毒（FMDV）、人腺病毒5型（hAdV5）、人鼻病毒14型（HRV14）都可以通過ADIG方式清除。此外，與抗體結(jié)合的細(xì)菌（如沙門氏菌），在進(jìn)入靶細(xì)胞后也可以與TRIM21結(jié)合并與自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3共定位。由此推測，沙門氏菌的降解可能與自噬途徑有關(guān)。最近的研究表明，錯誤折疊的微管相關(guān)蛋白tau攜帶抗體進(jìn)入細(xì)胞后也可以通過ADIG過程降解。然而包膜病毒在感染細(xì)胞時，需要依賴于膜囊與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，這就使得與病毒結(jié)合的抗體分子被限制在細(xì)胞外而無法進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。此外，即使抗體伴隨著病毒內(nèi)吞作用進(jìn)入了胞內(nèi)體，在隨后的病毒與胞內(nèi)體融合進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的過程中,抗體也會被滯留在胞內(nèi)體中無法到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，也就無法與TRIM21在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合。例如，呼吸道合胞體病毒（RSV）就不會被TRIM21檢測到進(jìn)而激活A(yù)DIN。某些非包膜病毒（如HRV2和脊髓灰質(zhì)炎病毒）,在由胞內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時，蛋白衣殼及與之結(jié)合的抗體分子也沒有與病毒RNA一起釋放入細(xì)胞質(zhì),從而逃避TRIM21的檢測。