透析袋在使用前如何處理透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備過(guò)程中，除鹽、除少量有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。

透析只需要使用專用的半透膜即可完成。通常是將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。

透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓，擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4℃透析，升高溫度可加快透析速度。

透析膜可用動(dòng)物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素（再生纖維素RC、纖維素酯CE、PVDF等）制成的透析膜，目前常用的是美國(guó)美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司（spectrum，上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司是中華區(qū)特約總經(jīng)銷）和美國(guó)UnionCarbide（聯(lián)合碳化物公司，上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司是華東區(qū)特約經(jīng)銷商）生產(chǎn)的各種尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，縮寫為MwCO）大概有100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000等種類，單位為道爾頓（D）。

商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為8mm～77mm不等。為防干裂，出廠時(shí)都用10％的甘油處理過(guò)，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，它們對(duì)蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害，用前必須除去。

透析膜可用動(dòng)物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜，目前常用的是美國(guó)UnionCarbide（聯(lián)合碳化物公司）和美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量）通常為1萬(wàn)左右。截留分子量越大也就是說(shuō)透過(guò)性越大，一般而言，透析袋截留分子量越小價(jià)格越貴，因?yàn)榻亓舻姆肿釉叫∫笸肝龃矫埽瑑r(jià)格越貴。

透析袋使用前處理：1.把透析袋剪成適當(dāng)長(zhǎng)度（10-20cm）的小段。

2.在大體積的2%(W/V)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。

3.用蒸餾水徹底清洗透析袋。

4.放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中將之煮沸10分鐘。

前處理也可以將透析袋放在廣口瓶中充滿水，松動(dòng)瓶蓋，于20psi（1.40kg/cm2)高壓滅菌10min，代替第四步用1mmol/LEDTA(PH=8)中煮沸10min的操作。

5.冷卻后，存放于4度，必須確保透析袋始終浸沒(méi)在溶液內(nèi)。若長(zhǎng)時(shí)間不用，可加少量疊氮鈉NaN2，以防長(zhǎng)菌。從此時(shí)起取用透析袋是必須戴手套。

6.用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，將之清洗干凈。洗凈涼干的透析袋彎折時(shí)易裂口，用時(shí)必須仔細(xì)檢查，不漏時(shí)方可重復(fù)使用。

這樣做可以保證透析袋有良好的透析效果。

7.新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。

8.佰易聚商城技術(shù)說(shuō)：透析袋不推薦反復(fù)使用，如果要反復(fù)使用就是用之前怎么處理的，用后也怎么處理。

9.透析袋要看你購(gòu)買的是可再生的還是一次性的。即使是可再生的也請(qǐng)使用于同種蛋白，避免交叉污染。

10.短時(shí)間內(nèi)再次使用的話，可用去離子水洗凈后，浸泡于20%乙醇溶液中，使用時(shí)務(wù)必將乙醇洗凈。

11.使用后的透析袋保存方法：.用生理鹽水浸泡以去掉蛋白，并用蒸餾水清洗干凈，然后置于50％乙醇中保存即可

美國(guó)美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的透析袋大部分是預(yù)處理過(guò)的，即用型，使用前只需用蒸餾水沖洗即可使用，spectra/por7系列和生物技術(shù)級(jí)的透析袋基本不含硫化物和重金屬離子。

使用時(shí)，一端用橡皮筋或線繩扎緊，也可以使用特制的透析袋夾夾緊，由另一端灌滿水，用手指稍加壓，檢查不漏，方可裝入待透析液，通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過(guò)程中，透析的小分子量較大時(shí)，袋外的水和緩沖液過(guò)量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。含鹽量很高的蛋白質(zhì)溶液透析過(guò)夜時(shí)，體積增加50％是正常的。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析，可在袋內(nèi)放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。

檢查透析效果的方法是：用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3檢查NaCl、KCl等。

透析納米顆粒帶有機(jī)溶劑的，如何處理透析袋重復(fù)使用？先看是美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)的還是美國(guó)聯(lián)合碳化的透析袋？美國(guó)公司的方法都不一樣的。大多數(shù)先用50％乙醇煮沸1小時(shí)，再依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。實(shí)驗(yàn)證明，50％乙醇處理對(duì)除去具有紫外吸收的雜質(zhì)特別有效。

透析膜(前處理方法如下)：

1.戴手套把透析膜剪成適當(dāng)長(zhǎng)度，浸在蒸餾水中15min泡軟。

2.浸入10mMsodiumbicarbonate中，并加熱至80℃，一邊攪拌至少30min。

3.換到10mMNa2·EDTA中浸泡30min，以新鮮的EDTA同樣方法處理三次。

4.再用80℃蒸餾水洗30min，然后換到20%酒精中，放在4℃冰箱中保存。

透析是利用半透膜的選擇性在溶液里分離大分子和小分子的一種分離技術(shù)，常常用于除去蛋白或核酸樣品中的鹽、變性劑、還原劑之類的小分子雜質(zhì)，有時(shí)也用于置換樣品緩沖液。樣品在膜的一邊，緩沖液在另一邊，小分子即向兩邊擴(kuò)散直到平衡透析是利用半透膜的選擇性在溶液里分離大分子和小分子的一種分離技術(shù)，常常用于除去蛋白或核酸樣品中的鹽、變性劑、還原劑之類的小分子雜質(zhì)，有時(shí)也用于置換樣品緩沖液。樣品在膜的一邊，緩沖液在另一邊，小分子即向兩邊擴(kuò)散直到平衡,而大分子則由于半透膜的阻攔而留在一端，通過(guò)不斷更換緩沖液，即可將樣品中要除掉的小分子稀釋到足夠低的濃度。該技術(shù)自五十年代發(fā)展流行起來(lái)，主要使用半透膜制成的透析袋作為工具，一直存在透析時(shí)間長(zhǎng)、樣品回收率不高、無(wú)法處理微量樣品的難題。如今Pierce公司推出三種不同的透析工具有效解決了部分問(wèn)題.

這是專為10到100微升的微量樣品透析而設(shè)計(jì)的。把樣品加在平底的透析管（類似小量提質(zhì)粒的離心純化柱MiniSpin，可以插入1.5毫升的離心管中，管底是半透膜)中，再插入特制的浮板（浮漂）中，置于緩沖液面10分鐘即完成透析。實(shí)驗(yàn)表明，100微升pH2.8的IgG洗脫液在1升pH9.4的緩沖液中只需不到10分鐘即可平衡到pH9.4。如果在裝緩沖液的燒杯底加磁力棒攪拌則更能加速透析速度。這種方法有較高的回收率，能夠節(jié)約珍貴的樣品，并能節(jié)約時(shí)間，特別適合摸條件的預(yù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)半透膜的孔徑和分子量截留值（分離范圍）可分為3種規(guī)格：3.5KMWCO、7KMWCO和10KMWCO。

透析袋直徑大約2cm，樣品為大分子溶液，長(zhǎng)度約10cm，請(qǐng)問(wèn)一般多久需要換水，多少天可以除去小分子？

簡(jiǎn)單的做法是每過(guò)1天換水一次，總共換水4-5次。

專業(yè)點(diǎn)的做法是，把水置于下面，下面為蒸餾瓶，上面是冷凝管及透析袋，帶一個(gè)連通器，上面的水滿了就會(huì)自動(dòng)跑到蒸餾瓶里，達(dá)到無(wú)限循環(huán)不斷把小分子透析到底部蒸餾瓶中。

另外實(shí)驗(yàn)室里比較常見(jiàn)的做法是：利用反滴法分級(jí)沉淀，大分子會(huì)傾向于凝聚，而小分子一般不會(huì)析出，即使析出也會(huì)以小顆粒狀分散于溶液，一般用反滴法得到的產(chǎn)物在氫核磁共振譜上是看不到小分子的吸收峰的，純度很高。

為了提高透析效率，還可以使用各種透析裝置。使用者也可以自行設(shè)計(jì)與制作各種簡(jiǎn)易的透析裝置。美國(guó)美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種型號(hào)的透析設(shè)備，由于使用對(duì)流透析的原理，使透析速度和效率大大提高。

選用透析袋需要知道目的物質(zhì)的分子量，每次處理的樣品量，同一批次的平行試驗(yàn)，是否需要保持目的物質(zhì)的活性來(lái)選擇，目前國(guó)內(nèi)使用的透析袋主要由上海歐韋達(dá)儀器科技有限公司提供，該公司能提供專業(yè)的技術(shù)指導(dǎo)。

普通型透析袋是再生纖維素，英文縮寫RC。比如美國(guó)viskase的透析袋，

再生纖維素是纖維素的一種，

再生纖維素主要是指人工化學(xué)合成的。

煮透析袋時(shí)EDTA和NAHCO3的作用是什么?EDTA，二價(jià)金屬離子螯合劑，除去鈣鎂等二價(jià)離子，防止他們跟目的樣品螯合，影響活性

NaHCO3，中和乙酸，延長(zhǎng)透析袋壽命。

2%(W/V)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)煮沸后我直接就透析了，忘了再1mmol/LEDTA(pH8.0)煮沸了，透析效果會(huì)不會(huì)不好？沒(méi)有EDTA煮問(wèn)題不大。EDTA煮主要是為了除去生產(chǎn)時(shí)附在透析袋上的金屬離子的。如果你的蛋白對(duì)金屬不敏感的話，第一次煮過(guò)就差不多了。

市售透析袋大多都是纖維素成分的，在做透析時(shí)容易發(fā)生破袋現(xiàn)象。簡(jiǎn)單的解決方法就是套兩層透析袋。這樣可以保證在透析所需時(shí)間中不會(huì)都破袋。即便是含有纖維素酶，這時(shí)候它也幾乎沒(méi)有活性。因?yàn)闃悠分羞€含有其他雜質(zhì)，再加上不在適宜的反應(yīng)PH和水解溫度下?？赡苁悄阃肝龃b液時(shí)的預(yù)留空間不夠，應(yīng)留1/3-1/2空間。硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白質(zhì)的原理和方法是什么

原理就是溶液中的離子強(qiáng)度不同時(shí)，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，步驟就是不斷加硫酸銨…以血漿為例：加到鹽濃度20~30%時(shí)纖維蛋白原沉淀，再加到濃度50%時(shí)球蛋白沉淀，飽和時(shí)清蛋白沉淀…

一，基本原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來(lái)表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。

原理就是溶液中的離子強(qiáng)度不同時(shí)，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，步驟就是不斷加硫酸銨…以血漿為例：加到鹽濃度20~30%時(shí)纖維蛋白原沉淀，再加到濃度50%時(shí)球蛋白沉淀，飽和時(shí)清蛋白沉淀…

二，試劑及儀器

1.

組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等

2.硫酸銨（NH4）2SO4

3.飽和硫酸銨溶液（SAS）

4.

蒸餾水

5.PBS(含0.2g/L

疊氮鈉

)

6.

透析袋

7.

超速離心機(jī)

8.pH計(jì)

9.

磁力攪拌器

三，操作步驟

以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來(lái)介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來(lái)分離抗體的硫酸銨飽和度為33%—50%。

（一）配制飽和硫酸銨溶液（SAS）

1.將767g（NH4）2SO4邊攪拌邊慢慢加到1升

蒸餾水中。用氨水或硫酸調(diào)到硫酸pH7.0。此即飽和度為100%的硫酸銨溶液（4.1mol/L,25°C）.

2.其它不同飽和度銨溶液的配制

（二）沉淀

1.樣品

20000′g離心30min，除去細(xì)胞碎片；

2.保留上清液并測(cè)量體積；

3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的SAS到上清液中，終濃度為1：1

4.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)或攪拌過(guò)夜（4°C），使蛋白質(zhì)充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白質(zhì)溶液10000′g離心30min（4°C）。棄上清保留沉淀；

2.將沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對(duì)PBS-0.2g/L疊氮鈉透析24-48小時(shí)（4°C），每隔3-6小時(shí)換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；

3.透析液離心，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。

四.應(yīng)用提示

（一）先用較低濃度的硫酸氨預(yù)沉淀，除去樣品中的雜蛋白。

1.邊攪拌邊慢慢加SAS到樣品溶液中，使?jié)舛葹?.5:1(v/v)；

2.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)或過(guò)夜（4°C）；3.3000′g離心30min（4°C），保留上清液；上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；

5.雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時(shí)，用預(yù)沉淀除雜蛋白是非常有效