免疫組織化學(xué)技術(shù)

的原理及方法

免疫組織化學(xué)技術(shù)

的原理及方法

1目錄一.基本知識二.基本原理三.方法四.結(jié)果的判斷及異常著色原因分析和對策五.臨床意義目錄一.基本知識2一、免疫組化技術(shù)的基本知識一、免疫組化技術(shù)的基本知識3一、免疫組化技術(shù)的基本知識

免疫組化的基本概念

免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。一、免疫組化技術(shù)的基本知識

免疫組化的基本概念4一、免疫組化技術(shù)的基本知識

抗體與抗原能特異性結(jié)合—生物學(xué)結(jié)合是免疫球蛋白Ig抗原兩個主要屬性：免疫原性及特異反應(yīng)性，蛋白質(zhì)具有抗原性一、免疫組化技術(shù)的基本知識

抗體5免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)五種免疫球蛋白只有兩種類型的輕鏈，即：Kappa(κ)和Lambda(λ)每個抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨的抗體分子決不可能既有κ鏈又有λ鏈。這一點在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名IgG(γ),6免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fc(Fragmentcrystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意為結(jié)晶片段，因其純化時呈結(jié)晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關(guān)Fab(Fragmentantigenbingding)該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位，每分子Ig能結(jié)合2個抗原分子免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fc(Fragmentcrystal7

多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生

多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對多個抗原決定簇產(chǎn)生的抗體單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單株淋巴細(xì)胞（克隆）所產(chǎn)生的抗體

多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生

多克隆抗體：多株B細(xì)胞針8多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體的產(chǎn)生以純化的抗原免疫動物而獲得，實際上是針對多個抗原決定簇的多個抗體組成，檢測范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國外產(chǎn)品目錄上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗體亦可產(chǎn)生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動物來源種類，對后繼抗體的選用至關(guān)重要。多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體的產(chǎn)生9多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)生應(yīng)用細(xì)胞融合的雜交瘤（Hybridization），以針對單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（腫瘤性B細(xì)胞）融合形成雜交瘤，其特點是既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內(nèi)而獲單克隆抗體，由此產(chǎn)生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現(xiàn)在亦有兔的單克隆抗體。多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)生10抗原的制備：傳統(tǒng)用蛋白提純近來可應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)：已知抗原的基因結(jié)構(gòu)，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現(xiàn)有兔的單抗抗原的制備：11多克隆抗體的選用1、單克隆抗體的制備比多克隆抗體復(fù)雜，價格更貴；在應(yīng)用中不一定比多克隆抗體好。2、單克隆抗體的特異性強(qiáng)，多克隆抗體則敏感性高，如何選用完全決定于使用的目的性。多克隆抗體的選用12

標(biāo)記抗體

1、在抗體上用化學(xué)方法聯(lián)接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到2、標(biāo)記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明酶：辣根過氧化酶，堿性磷酸酶金屬離子：膠體金顆粒3、標(biāo)記的方法：化學(xué)性結(jié)合將降低抗體效價及標(biāo)記物的活性，從而使染色敏感性降低

標(biāo)記抗體

13酶—抗酶抗體復(fù)合物

通過免疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將酶結(jié)合到抗體上，形成具酶活性的免疫復(fù)合物。如PAP復(fù)合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP復(fù)合物屬非標(biāo)記性，保護(hù)了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍。酶—抗酶抗體復(fù)合物

通過免疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將14酶標(biāo)親和素在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感酶標(biāo)親和素在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與15

多聚物載體

1、核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用2、一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物

多聚物載體

16二、免疫過氧化物酶染色技

術(shù)的基本原理

二、免疫過氧化物酶染色技

術(shù)的基本原理

17免疫過氧化酶染色技術(shù)的

基本原理

顯色系統(tǒng)：三抗、酶、底物聯(lián)結(jié)系統(tǒng)：二抗識別系統(tǒng)：一抗、組織抗原免疫過氧化酶染色技術(shù)的

基本原理

顯色系統(tǒng)：三抗、酶、底物18識別系統(tǒng)1、特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具有識別并結(jié)合靶抗原的功能，這是本技術(shù)的理論依據(jù)所在2、特異性抗體品種繁多，應(yīng)根據(jù)待檢測抗原的要求選用3、特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據(jù)不同染色要求而選用4、識別系統(tǒng)的組成比較恒定，識別功能由特異的第一抗完成識別系統(tǒng)1、特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具19顯示系統(tǒng)1、也是顯色系統(tǒng)?？贵w抗原的結(jié)合是肉眼看不見的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反應(yīng)變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位2、顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標(biāo)記位點形成有色分子的終末產(chǎn)物，若顯色劑為DAB，則出現(xiàn)棕褐色細(xì)顆粒沉淀E(酶)+S(底物)→E?S(酶底物復(fù)合物)→P(反應(yīng)產(chǎn)物)+E(酶)E(酶)可循環(huán)使用

顯示系統(tǒng)20顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過程:HRP+H2O2→HRP?H2O2→有色分子終末產(chǎn)物+HRPDAB（電子供體）HRP：酶H2O2：底物HRP?H2O2：酶?底物復(fù)合物顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過程:21顯示系統(tǒng)免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標(biāo)法：利用標(biāo)記于橋聯(lián)抗體的酶PAP法：利用PAP復(fù)合物ABC法：利用AB復(fù)合物L(fēng)SAB法:利用直接標(biāo)記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設(shè)法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統(tǒng)免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點22聯(lián)結(jié)系統(tǒng)1、聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體）2、按免疫學(xué)要求將識別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯(lián)結(jié)成為統(tǒng)一體3、應(yīng)采用何種聯(lián)結(jié)抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。孩湃粢豢故嵌嗫寺】贵w，則二抗是羊或其它動物的抗兔血清；⑵若一抗是單克隆抗體，則二抗常是兔抗鼠的血清4、有的聯(lián)結(jié)抗體既能聯(lián)結(jié)多抗，亦能聯(lián)結(jié)單抗聯(lián)結(jié)系統(tǒng)1、聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體）23三、免疫組化染色方法的類別

三、免疫組化染色方法的類別

24免疫組化染色方法的類別

直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）免疫組化染色方法的類別

直接法25直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標(biāo)記直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、26間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產(chǎn)生的多克隆抗體，其酶標(biāo)抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數(shù)幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）27PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法

組成：1、一抗是針對靶抗原的特異性抗體2、二抗是聯(lián)結(jié)抗體，一面聯(lián)結(jié)一抗，另一面聯(lián)結(jié)PAP復(fù)合物3、三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復(fù)合物（PAP）PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法

組成：28優(yōu)點PAP復(fù)合物中含酶更多，且是一種非標(biāo)記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復(fù)合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片優(yōu)點29ABC法

親和素-生物素法

組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素）優(yōu)點：1、親和素和生物素有強(qiáng)大親和力，使其比直接和間接酶標(biāo)法更敏感，也超過PAP法。2、能用于常規(guī)石蠟切片。ABC法

親和素-生物素法

組成：一抗、生物素化的二抗、AB30親和素—生物素復(fù)合物

1、親和素有四個生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合2、親和素-生物素復(fù)合物是一個三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性3、AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中親和素—生物素復(fù)合物

1、親和素有四個生物素分子特異性結(jié)合部31LSAB（SP）法

標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法

特點：將HRP直接標(biāo)記于鏈霉親和素上優(yōu)點：1、更快速：空間結(jié)構(gòu)更小2、更敏感：鏈霉親和素的親和性更強(qiáng)，更易于到達(dá)深部位點3、非特異背景更少：鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結(jié)締組織）聯(lián)結(jié)LSAB（SP）法

標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法

特點：將HR32酶標(biāo)親和素

在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感酶標(biāo)親和素

在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素33一步法（EPOS）及兩步（Envision）

特點：以多聚體為載體，聯(lián)結(jié)了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點：1、操作簡便，省時2、提高了敏感性和特異性3、減少了背景著色4、避免內(nèi)源性生物素的干擾一步法（EPOS）及兩步（Envision）

特點：以多聚體34多聚物載體

一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物多聚物載體

一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPO35四、免疫組化染色結(jié)果的判

斷及異常著色的原因分析及

其對策

四、免疫組化染色結(jié)果的判

斷及異常著色的原因分析及

其對策

36免疫組化染色結(jié)果的判斷

特異性著色具備特點1、特定的定位：特定的組織、特定的細(xì)胞、特定的細(xì)胞內(nèi)的部位2、著色的不均一性：分布上的不均一、著色強(qiáng)度的不均一3、顆粒性顯色：DAB顯色劑應(yīng)為棕黃到棕褐色免疫組化染色結(jié)果的判斷

特異性著色具備特點37CK染色，結(jié)腸腺癌細(xì)胞膜特異性著色

CK染色，結(jié)腸腺癌細(xì)胞膜特異性著色

38Kappa胞漿著色

Kappa胞漿著色

39TdT染色，胞核著色

TdT染色，胞核著色

40PR胞核著色

PR胞核著色

41ER胞核著色

ER胞核著色

42免疫組化染色結(jié)果的判斷

對照的設(shè)置1、空白對照2、陽性對照3、吸收試驗對照4、替代對照5、自身對照免疫組化染色結(jié)果的判斷

對照的設(shè)置43異常著色（假陽性）原因及對策

異常著色原因：內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素、抗體本身原因、切片制作不當(dāng)、沖洗不充分、DAB顯色產(chǎn)生背景著色假陰性的原因：抗原的丟失、抗原的遮蔽、抗體試劑因素、操作不當(dāng)異常著色（假陽性）原因及對策

44非特異性著色原因及對策

內(nèi)源酶及內(nèi)源生物素↓1、滅活過氧化物酶-----3%H2O22、滅活內(nèi)源性生物素----蛋清封閉或更換不含生物素的染色系統(tǒng)3、滅活堿性磷酸酶非特異性著色原因及對策

內(nèi)源酶及內(nèi)源生物素45異常著色原因及對策

抗原自身原因↓1、抗體不純----應(yīng)用單克隆抗體2、標(biāo)本中含有與靶抗原相似的抗原決定簇-----采用具更特異性抗原決定簇的單克隆抗體異常著色原因及對策

抗原自身原因46異常著色原因及對策

切片制作不當(dāng)↓1、嚴(yán)重變性壞死及炎性病灶處2、切片裱貼不平3、褶皺處4、組織邊緣部異常著色原因及對策

切片制作不當(dāng)47異常著色原因及對策

1、清洗不充分→用含鹽的緩沖液充分沖洗，可利于減低背景著色2、DAB顯色產(chǎn)生背景著色→未除去DAB的不溶性顆粒、DAB保存不妥，其氧化產(chǎn)物沉淀在組織上異常著色原因及對策

48非特異性背景著色原因及對策

電荷吸附→加二抗動物非免疫血清（牛血清也常用）非特異性背景著色原因及對策

49假陰性的原因分析及對策

㈠抗原的丟失標(biāo)本固定不及時、固定過久，浸蠟時間、溫度過高，均可將抗原性破壞㈡抗原的遮蔽1、福爾馬林固定石蠟包埋后，其抗原性因分子交聯(lián)而被遮蔽2、修復(fù)抗原，包括蛋白酶消化、微波加熱處理假陰性的原因分析及對策

㈠抗原的丟失50㈢抗體的因素1、有效性：一抗的特異性、效價、保存時間、保存條件及有無菌類污染2、抗體間的相互匹配：二抗與一抗、三抗與二抗不匹配，三抗必須是一抗同種動物來源的同型抗體免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及方法課件51㈣操作不當(dāng)1、掉片2、消化了不該消化的靶抗原3、切片放置不平抗體流失4、遺漏重要的操作步驟（如漏加HRP的底物）5、顯色時間過短

解決方法：嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行㈣操作不當(dāng)52五、臨床意義

近年來，隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認(rèn)可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時，準(zhǔn)確率可達(dá)50%-75%。五、臨床意義

53免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面：(1)惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；(2)確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；(3)對某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型；免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面：54(4)軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；(5)發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。(6)為臨床提供治療方案的選擇。(4)軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多55謝謝！謝謝！56免疫組織化學(xué)技術(shù)

的原理及方法

免疫組織化學(xué)技術(shù)

的原理及方法

57目錄一.基本知識二.基本原理三.方法四.結(jié)果的判斷及異常著色原因分析和對策五.臨床意義目錄一.基本知識58一、免疫組化技術(shù)的基本知識一、免疫組化技術(shù)的基本知識59一、免疫組化技術(shù)的基本知識

免疫組化的基本概念

免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。一、免疫組化技術(shù)的基本知識

免疫組化的基本概念60一、免疫組化技術(shù)的基本知識

抗體與抗原能特異性結(jié)合—生物學(xué)結(jié)合是免疫球蛋白Ig抗原兩個主要屬性：免疫原性及特異反應(yīng)性，蛋白質(zhì)具有抗原性一、免疫組化技術(shù)的基本知識

抗體61免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)五種免疫球蛋白只有兩種類型的輕鏈，即：Kappa(κ)和Lambda(λ)每個抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨的抗體分子決不可能既有κ鏈又有λ鏈。這一點在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名IgG(γ),62免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fc(Fragmentcrystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意為結(jié)晶片段，因其純化時呈結(jié)晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關(guān)Fab(Fragmentantigenbingding)該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位，每分子Ig能結(jié)合2個抗原分子免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fc(Fragmentcrystal63

多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生

多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對多個抗原決定簇產(chǎn)生的抗體單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單株淋巴細(xì)胞（克?。┧a(chǎn)生的抗體

多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生

多克隆抗體：多株B細(xì)胞針64多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體的產(chǎn)生以純化的抗原免疫動物而獲得，實際上是針對多個抗原決定簇的多個抗體組成，檢測范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國外產(chǎn)品目錄上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗體亦可產(chǎn)生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動物來源種類，對后繼抗體的選用至關(guān)重要。多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體的產(chǎn)生65多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)生應(yīng)用細(xì)胞融合的雜交瘤（Hybridization），以針對單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（腫瘤性B細(xì)胞）融合形成雜交瘤，其特點是既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內(nèi)而獲單克隆抗體，由此產(chǎn)生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現(xiàn)在亦有兔的單克隆抗體。多克隆抗體與單多克隆抗體及其產(chǎn)生單克隆抗體的產(chǎn)生66抗原的制備：傳統(tǒng)用蛋白提純近來可應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)：已知抗原的基因結(jié)構(gòu)，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現(xiàn)有兔的單抗抗原的制備：67多克隆抗體的選用1、單克隆抗體的制備比多克隆抗體復(fù)雜，價格更貴；在應(yīng)用中不一定比多克隆抗體好。2、單克隆抗體的特異性強(qiáng)，多克隆抗體則敏感性高，如何選用完全決定于使用的目的性。多克隆抗體的選用68

標(biāo)記抗體

1、在抗體上用化學(xué)方法聯(lián)接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到2、標(biāo)記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明酶：辣根過氧化酶，堿性磷酸酶金屬離子：膠體金顆粒3、標(biāo)記的方法：化學(xué)性結(jié)合將降低抗體效價及標(biāo)記物的活性，從而使染色敏感性降低

標(biāo)記抗體

69酶—抗酶抗體復(fù)合物

通過免疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將酶結(jié)合到抗體上，形成具酶活性的免疫復(fù)合物。如PAP復(fù)合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP復(fù)合物屬非標(biāo)記性，保護(hù)了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍。酶—抗酶抗體復(fù)合物

通過免疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將70酶標(biāo)親和素在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感酶標(biāo)親和素在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與71

多聚物載體

1、核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用2、一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物

多聚物載體

72二、免疫過氧化物酶染色技

術(shù)的基本原理

二、免疫過氧化物酶染色技

術(shù)的基本原理

73免疫過氧化酶染色技術(shù)的

基本原理

顯色系統(tǒng)：三抗、酶、底物聯(lián)結(jié)系統(tǒng)：二抗識別系統(tǒng)：一抗、組織抗原免疫過氧化酶染色技術(shù)的

基本原理

顯色系統(tǒng)：三抗、酶、底物74識別系統(tǒng)1、特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具有識別并結(jié)合靶抗原的功能，這是本技術(shù)的理論依據(jù)所在2、特異性抗體品種繁多，應(yīng)根據(jù)待檢測抗原的要求選用3、特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據(jù)不同染色要求而選用4、識別系統(tǒng)的組成比較恒定，識別功能由特異的第一抗完成識別系統(tǒng)1、特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具75顯示系統(tǒng)1、也是顯色系統(tǒng)?？贵w抗原的結(jié)合是肉眼看不見的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反應(yīng)變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位2、顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標(biāo)記位點形成有色分子的終末產(chǎn)物，若顯色劑為DAB，則出現(xiàn)棕褐色細(xì)顆粒沉淀E(酶)+S(底物)→E?S(酶底物復(fù)合物)→P(反應(yīng)產(chǎn)物)+E(酶)E(酶)可循環(huán)使用

顯示系統(tǒng)76顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過程:HRP+H2O2→HRP?H2O2→有色分子終末產(chǎn)物+HRPDAB（電子供體）HRP：酶H2O2：底物HRP?H2O2：酶?底物復(fù)合物顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過程:77顯示系統(tǒng)免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標(biāo)法：利用標(biāo)記于橋聯(lián)抗體的酶PAP法：利用PAP復(fù)合物ABC法：利用AB復(fù)合物L(fēng)SAB法:利用直接標(biāo)記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設(shè)法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統(tǒng)免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點78聯(lián)結(jié)系統(tǒng)1、聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體）2、按免疫學(xué)要求將識別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯(lián)結(jié)成為統(tǒng)一體3、應(yīng)采用何種聯(lián)結(jié)抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。孩湃粢豢故嵌嗫寺】贵w，則二抗是羊或其它動物的抗兔血清；⑵若一抗是單克隆抗體，則二抗常是兔抗鼠的血清4、有的聯(lián)結(jié)抗體既能聯(lián)結(jié)多抗，亦能聯(lián)結(jié)單抗聯(lián)結(jié)系統(tǒng)1、聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體）79三、免疫組化染色方法的類別

三、免疫組化染色方法的類別

80免疫組化染色方法的類別

直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）免疫組化染色方法的類別

直接法81直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標(biāo)記直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、82間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產(chǎn)生的多克隆抗體，其酶標(biāo)抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數(shù)幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）83PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法

組成：1、一抗是針對靶抗原的特異性抗體2、二抗是聯(lián)結(jié)抗體，一面聯(lián)結(jié)一抗，另一面聯(lián)結(jié)PAP復(fù)合物3、三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復(fù)合物（PAP）PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法

組成：84優(yōu)點PAP復(fù)合物中含酶更多，且是一種非標(biāo)記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復(fù)合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片優(yōu)點85ABC法

親和素-生物素法

組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素）優(yōu)點：1、親和素和生物素有強(qiáng)大親和力，使其比直接和間接酶標(biāo)法更敏感，也超過PAP法。2、能用于常規(guī)石蠟切片。ABC法

親和素-生物素法

組成：一抗、生物素化的二抗、AB86親和素—生物素復(fù)合物

1、親和素有四個生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合2、親和素-生物素復(fù)合物是一個三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性3、AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中親和素—生物素復(fù)合物

1、親和素有四個生物素分子特異性結(jié)合部87LSAB（SP）法

標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法

特點：將HRP直接標(biāo)記于鏈霉親和素上優(yōu)點：1、更快速：空間結(jié)構(gòu)更小2、更敏感：鏈霉親和素的親和性更強(qiáng)，更易于到達(dá)深部位點3、非特異背景更少：鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結(jié)締組織）聯(lián)結(jié)LSAB（SP）法

標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法

特點：將HR88酶標(biāo)親和素

在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感酶標(biāo)親和素

在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素89一步法（EPOS）及兩步（Envision）

特點：以多聚體為載體，聯(lián)結(jié)了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點：1、操作簡便，省時2、提高了敏感性和特異性3、減少了背景著色4、避免內(nèi)源性生物素的干擾一步法（EPOS）及兩步（Envision）

特點：以多聚體90多聚物載體

一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物多聚物載體

一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPO91四、免疫組化染色結(jié)果的判

斷及異常著色的原因分析及

其對策

四、免疫組化染色結(jié)果的判

斷及異常著色的原因分析及

其對策

92免疫組化染色結(jié)果的判斷

特異性著色具備特點1、特定的定位：特定的組織、特定的細(xì)胞、特定的細(xì)胞內(nèi)的部位2、著色的不均一性：分布上的不均一、著色強(qiáng)度的不均一3、顆粒性顯色：DAB顯色劑應(yīng)為棕黃到棕褐色免疫組化染色結(jié)果的判斷

特異性著色具備特點93CK染色，結(jié)腸腺癌細(xì)胞膜特異性著色

CK染色，結(jié)腸腺癌細(xì)胞膜特異性著色

94Kappa胞漿著色

Kappa胞漿著色

95TdT染色，胞核著色

TdT染色，胞核著色

96PR胞核著色

PR胞核著色

97ER胞核著色

ER胞核著色

98免疫組化染色結(jié)果的判斷

對照的設(shè)置1、空白對照2、陽性對照3、吸收試驗對照4、替代對照5、自身對照免疫組化染色結(jié)果的判斷

對照的設(shè)置99異常著色（假陽性）原因及對策

異常著色原因：內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素、抗體本身原因、切片制作不當(dāng)、沖洗不充分、DAB顯色產(chǎn)生背景著色假陰性的原