目錄TOC\o摘要 Arabic-1-引言 Arabic-1-1.材料與方法 Arabic-3-1.1實(shí)驗(yàn)材料 Arabic-3-1.1.1菌株 Arabic-3-1.1.2體質(zhì)粒載 Arabic-3-1.1.2酶和試劑 Arabic-3-1.1.2.1酶 Arabic-3-1.1.2.2抗生素 Arabic-4-1.1.2.3生化試劑 Arabic-4-1.2儀器設(shè)備 Arabic-4-1.3實(shí)驗(yàn)方法 Arabic-4-1.3.1酶切 Arabic-4-1.3.2DNA片段補(bǔ)平 Arabic-5-1.3.3大片段去磷酸化 1.3.4乙醇沉淀純化DNA Arabic-5-1.3.5膠回收 Arabic-6-1.3.6連接 1.3.7KODplus高保真酶PCR反應(yīng) 1.3.8檢測(cè)PCR反應(yīng) Arabic-7-1.3.9Gateway技術(shù) 1.3.9.1BP反應(yīng) Arabic-8-1.3.10大腸桿菌轉(zhuǎn)化 1.3.11質(zhì)粒提取 Arabic-8-2.結(jié)果與分析 Arabic-9-2.1pWBVec8+Ga-b載體的酶切 Arabic-9-2.2載體去磷酸化 Arabic-10-2.3載體補(bǔ)平 Arabic-10-2.4Cas9質(zhì)粒的酶切 Arabic-10-2.5含有Cas9元件片段的補(bǔ)平 Arabic-11-2.6Cas9元件片段與載體的連接 Arabic-11-2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR質(zhì)粒檢測(cè) Arabic-11-2.8入門載體的構(gòu)建 Arabic-12-3.討論 Arabic-13-參考文獻(xiàn) Arabic-15-致謝 Arabic-17-PAGE\*Arabic19集胞藻6803基因的克隆及植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建摘要：關(guān)鍵詞：Gateway技術(shù)Keywords:Gatewaytechnology引言藍(lán)藻是地球上最原始、最古老的一群植物，分布很廣，主要生活在淡水中，海水中也有。藍(lán)藻它是在地球上幾乎還是絕對(duì)無氧的還原環(huán)境下，第一個(gè)利用太陽能將二氧化碳制造成有機(jī)物并釋放出游離氧氣的先驅(qū)生物，它對(duì)地球上的其他自養(yǎng)生物和異養(yǎng)生物的產(chǎn)生和演化，乃至人類的起源有著無可替代的重大意義。藍(lán)藻藻體有單細(xì)胞體、群體和少數(shù)絲狀體，為原核生物，細(xì)胞壁在電鏡下分為四層，原生質(zhì)體由中心質(zhì)和周質(zhì)組成，中心質(zhì)含有DNA，無核仁和核膜結(jié)構(gòu)，稱為原核。周質(zhì)中有很多扁平膜狀的光合作用片層，呈條狀有規(guī)律的排列，分布在其表面的色素有葉綠素a、藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白及一些黃色色素。藍(lán)藻的光合作用產(chǎn)物為藍(lán)藻淀粉和藍(lán)藻顆粒體。周質(zhì)中還有氣泡。藍(lán)藻約有150屬，1500種，分布很廣，從兩極到赤道，從高山到海洋，到處都有它們的蹤跡。根據(jù)其植物體的形態(tài)不同而分為三個(gè)綱：1、色球藻綱：包括所有單細(xì)胞體和單細(xì)胞群體種類。2、藻殖段綱：包括所有不分枝或假分枝絲狀體種類及絲狀群體種類。3、真枝藻綱：包括所有具真分枝的絲狀體種類。?；蚪M編輯就是指定點(diǎn)改造基因組，得到預(yù)期的生物體基因組序列從而發(fā)生遺傳改變的技術(shù)，主要是進(jìn)行DNA序列的敲除、插入、定點(diǎn)突變和組合編輯等，從而實(shí)現(xiàn)基因功能與調(diào)控元件的系統(tǒng)研究[1]。從基因組的角度出發(fā)對(duì)植物基因進(jìn)行人工改造從而培育優(yōu)良品種具有非常重要的意義。由于外源DNA與基因組靶基因發(fā)生同源重組效率很低，因此對(duì)植物基因組進(jìn)行人工改造就顯得異常困難。近年來，人們借用人工改造核酸酶來提高同源重組的效率，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組的精確、定向的人工改造。目前應(yīng)用于基因組編輯主要包括巨核酶技術(shù)(Meganucleases)、鋅指核酸酶(ZFN)、以及TALEN核酸酶，它們已在植物基因工程中已經(jīng)得到了成功的應(yīng)用。然而傳統(tǒng)基因組編輯技術(shù)存在明顯不足，例如，ZFN和TALEN對(duì)于每一個(gè)新的ZFN或TALEN嵌合蛋白質(zhì)都需要被改造才能識(shí)別靶序列，這就使兩種基因組編輯系統(tǒng)廣泛應(yīng)用受阻。然而最近發(fā)現(xiàn)的CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)只需要一小段引導(dǎo)RNA就能夠識(shí)別特定的DNA[2]。而且一個(gè)新的位點(diǎn)只需要一個(gè)新的引導(dǎo)RNA，極大的簡(jiǎn)化了基因組編輯的過程，擴(kuò)大了靶位點(diǎn)的選擇。CRISPR系統(tǒng)也可以應(yīng)用于靶向基因突變和基因修正，并且該系統(tǒng)也容易設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)大片段DNA缺失以及用于復(fù)合基因編輯。CRISPR-Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-CRISPR-associatedproteins)系統(tǒng)是細(xì)菌與古生菌中用來抵御外源病毒或質(zhì)粒DNA入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。對(duì)于一個(gè)典型的CRISPR位點(diǎn)而言通常包含若干長度為20-50bp的保守性的正向重復(fù)序列和被其間隔開的短的非重復(fù)序列，以及位于重復(fù)上游的引導(dǎo)序列[3]。CRISPR系統(tǒng)存在三種類型，尤其以=2\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"2型CRISPR系統(tǒng)研究較多，在=2\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"2型CRISPR系統(tǒng)中存在Cas9核酸酶，又稱CRISPR/Cas9系統(tǒng)。Cas9核酸酶具有改造crRNA和破壞雙鏈DNA的雙重功能[7]。位于sgRNA5‘端的20個(gè)左右的堿基決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)在應(yīng)用時(shí)Cas9核酸酶特異性切割的部位，主要負(fù)責(zé)決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，因此，只要改變這段引導(dǎo)RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上，如果同時(shí)引用多個(gè)引導(dǎo)RNA也可同時(shí)進(jìn)行基因組上多個(gè)不同位點(diǎn)的編輯，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)合基因的編輯。CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的植物基因的定點(diǎn)突變?cè)頌椋菏紫龋珻as9蛋白與sgRNA形成復(fù)合體。其次，上述復(fù)合體切割與sgRNA的spacer互補(bǔ)的基因組DNA序列，隨后造成雙鏈DNA的損傷。最后通過體內(nèi)的NHEJ或HR修復(fù)機(jī)制將引入基因突變[4]。受序列的限制以往的CRISPR載體往往是兩個(gè)載體，也即表達(dá)sgRNA和Cas9元件位于不同的載體，共轉(zhuǎn)化效率較低，為了克服這一困難，我們采用酶切連接和Gateway技術(shù)構(gòu)建便式表達(dá)載體。我們已經(jīng)了解sgRNA5‘端的20個(gè)左右的堿基決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，但是20個(gè)左右的堿基片段鏈接不方便，使用起來操作不方便效率偏低。本研究利用Gateway技術(shù)和改進(jìn)后的定點(diǎn)突變技術(shù)將基因特異的靶序列構(gòu)建到通用載體中得到表達(dá)特異基因sgRNA的入門載體，將其與目標(biāo)載體同源重組即可得到特異的基因表達(dá)載體。1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1菌株大腸桿菌DB3.1和Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均有周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2質(zhì)粒載體入門載體：pDONR207周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供表達(dá)載體：周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供1.1.3酶和試劑1.1.3.1酶KODplusDNA聚合酶(Toyobo)T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)熱敏磷酸化酶(NewEnglandBiolabs)1.1.3.2抗生素Gentamycin(Sigma)Spectinomycin(Sigma)1.1.3.3實(shí)驗(yàn)試劑瓊脂、TAE緩沖液、Goldwiew試劑、6x上樣緩沖液（loadingbuffer）、DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物、無水乙醇、75%乙醇、異丙醇、75%甘油、蒸餾水、LB培養(yǎng)基各組成成分、高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自艾德萊生物科技公司。1.2儀器設(shè)備普通PCR儀、超凈工作臺(tái)、精密電子天平、100mL的容量瓶、培養(yǎng)皿、移液槍、-20℃冰箱、-70℃冰箱、37℃搖床、37℃培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、電泳儀、制膠板、一次性手套、微波爐、水平電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、離心機(jī)等。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1集胞藻基因組的提取本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行KODPCR擴(kuò)增所需的模板(目的基因)為集胞藻的整個(gè)基因組，提取的方法為周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人員自己探索的方法，先將集胞藻離心收集于離心管中，加入提取液、溶菌酶、0.2mm的玻璃珠后，輕輕震蕩破碎集胞藻細(xì)胞，然后純化DNA，即得到集胞藻的整個(gè)基因組。1.3.2集胞藻6803CCM途徑基因的KODPCR擴(kuò)增1.3.2.1KODPCR反應(yīng)體系：總體系為50μlKODplus1μlMgSO43μldNTP5μlBuffer5μl模板1μlPrimer12μlPrimer22μlddH2O31μl1.3.2.2引物均為周口師范學(xué)院植物遺傳與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室購買，呈干粉狀態(tài)，先經(jīng)過高速離心，再稀釋100倍。1.3.2.3KODPCR的溫度設(shè)置：先經(jīng)過95℃預(yù)變性8分鐘，然后是95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，再經(jīng)過72℃終變性5min，16℃保存，即完成整個(gè)循環(huán)。1.3.3瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖0.2gTAE緩沖液20mLGoldwiew0.6μl(1)準(zhǔn)備。本實(shí)驗(yàn)需制備1%的瓊脂糖膠液，稱取0.2g瓊脂糖溶于20mL的電泳緩沖液TAE中。(2)熔解。微波爐加熱使瓊脂糖充分熔解。(3)加入Goldwiew。由于溴化乙錠毒性較大，故本實(shí)驗(yàn)加入核酸染色劑Goldwiew，需戴上一次性手套。(4)灌膠。本實(shí)驗(yàn)選擇的是小型制膠板，緩慢地將瓊脂糖膠液注入1個(gè)帶有“梳子”的膠床中，至膠完全凝固，約20分鐘左右。(5)放膠。代膠凝固之后，輕輕拔出梳子，將制膠板放在電泳槽內(nèi)，加樣孔一側(cè)靠近陰極(黑色電極)，注入適量的電泳緩沖液。(6)點(diǎn)樣。取適量KODPCR擴(kuò)增產(chǎn)物及DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物，加入6x上樣緩沖液，混勻，采用移液器進(jìn)行點(diǎn)樣：使吸管與加樣孔垂直，吸管尖端剛好在加樣孔開口之下，緩慢將DNA樣品加入加樣孔中。(7)電泳。加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源，黑色連陰極，紅色連陽極，電壓為130V，電流為135mA。(8)拍照、保存。跑膠30min后，切斷電源，取出凝膠，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。1.3.4KODPCR產(chǎn)物純化：硅膠膜吸附法緩沖液EB需事先預(yù)熱吸附柱先加入平衡液進(jìn)行平衡(1)300μl溶膠液、100μl異丙醇與PCR產(chǎn)物混合(2)混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱，室溫放置1min，3000rpm1min，12000rpm1min(3)將吸附柱內(nèi)下層液體倒掉，加入600μlWB（洗脫液），12000rpm1min(4)重復(fù)3。(5)將洗脫液倒掉以后，12000rpm2min(6)把吸附柱放入新的1.5EP管，加入50μl緩沖液EB，37℃烘箱放置5min，12000rpm1min1.3.5Gateway技術(shù)1.3.5.1BP反應(yīng)以構(gòu)建入門載體目的，5.2μl反應(yīng)體系，配比如下，25℃,水浴1-3h。轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌Trans-5阿爾法感受態(tài)細(xì)胞。PCR純化產(chǎn)物4μlpDONR2070.7μlBP重組酶0.5μl1.3.6Trans-5阿爾法感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化(1)-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將溶未溶時(shí)轉(zhuǎn)化效率最后。(2)加入BP反應(yīng)產(chǎn)物，10μl混勻，冰浴30min。(3)將感受態(tài)細(xì)胞在42℃水浴鍋中熱激90s，此過程要迅速。(4)取出后迅速轉(zhuǎn)移到冰山，冷卻2min。(5)無菌條件下，感受態(tài)中加入50μlLB培養(yǎng)液(不含抗生素)混勻后于37℃恒溫箱150rpm搖床45min。(6)在無菌條件下，均勻涂到含有Gen抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板37℃培養(yǎng)過夜。(7)挑單克隆。挑取大腸桿菌8處單菌落于8個(gè)50mL離心管中，加入LB培養(yǎng)液。(8)37℃恒溫箱150rpm搖床3h。1.3.7菌液PCR反應(yīng)驗(yàn)證入門載體是否轉(zhuǎn)到大腸桿菌內(nèi)，PCR反應(yīng)體系(15μl)。2×Mix7.5μlPrimer10.5μlPrimer20.5μl菌液1μlddH2O5.5μlPCR反應(yīng)的條件：95℃預(yù)變性8min,95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃終變性5min,16℃保存。1.3.8瓊脂糖凝膠電泳過程同1.3.31.3.9保菌75%的甘油與菌液1:1混勻后，放入-80液氮中。1.3.10質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA提取使用的是購自艾德萊生物科技公司的高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒，操作步驟如下：(1)搖菌：從LB固體培養(yǎng)基平板上挑取大腸桿菌的單菌落，接種至5ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，將其放置在搖床上，230rpm震蕩培養(yǎng)約8h。(2)集菌：取過夜培養(yǎng)的菌液，裝入2ml離心管中，12000rpm于室溫1min沉淀菌體，棄上清，反復(fù)進(jìn)行2-3次。(3)重懸：加入250μlBufferP1，充分混懸震蕩，使菌體徹底懸浮。(4)裂解：加入250μlBufferP2，上下溫和翻轉(zhuǎn)6-8次，使細(xì)菌完全裂解，室溫放置時(shí)間不能超過5min。(5)中和：加入350μlBufferP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，出現(xiàn)均勻白色絮狀沉淀，冰上放置5min,13000rpm離心10min。(6)柱平衡：向插入套管的吸附柱柱內(nèi)加入100μlBufferPE,13000rpm離心30s,棄去套管中的廢液。(7)將中和后離心的質(zhì)粒粗提物上清小心吸出并轉(zhuǎn)移至平衡過的吸附柱內(nèi)，13000rpm離心1min，棄上清。(8)清洗：向離心柱內(nèi)加入600μl漂洗液WB(已加乙醇)，13000rpm離心1min，棄上清。(9)再清洗：再次向吸附柱內(nèi)加入600μl漂洗液WB，13000rpm離心1min，棄上清。將吸附柱放回套管，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。(10)收吸附柱：取出吸附柱，放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管內(nèi)。(11)洗脫DNA:在吸附膜的中間部位加入70μlEB(已70℃加熱),70℃烘箱放置5-10min，13000rpm，離心1min。(12)再次洗脫DNA：在吸附膜的中間部位加入70μlEB(已70℃加熱),13000rpm，離心1min，將最終獲得的質(zhì)粒DNA溶液置于-20℃?zhèn)溆谩?.3.11瓊脂糖凝膠電泳過程同1.3.3和1.3.81.3.12LR反應(yīng)，以構(gòu)建表達(dá)載體目的，4.7μl反應(yīng)體系，配比如下，25℃,水浴1-3h。轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌Trans-5阿爾法感受態(tài)細(xì)胞入門載體3μlLR重組酶0.5μl載體1.2μl1.3.13Trans-5阿爾法感受態(tài)大腸桿菌轉(zhuǎn)化過程同1.3.61.3.14菌液PCR反應(yīng)過程同1.3.71.3.15瓊脂糖凝膠電泳過程同1.3.3、1.3.8、1.3.111.3.9保菌過程同1.3.91.3.17質(zhì)粒提取過程同1.3.101.3.18農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(1)從-80℃冰箱取出農(nóng)桿菌感受態(tài)，在冰上融化后加入10μl質(zhì)粒。(2)混勻后冰浴30min。(3)液氮中速凍90s(4)水浴鍋37℃保溫2min后，在超凈工作臺(tái)上加入500μlLB培養(yǎng)液，28℃、180rpm搖菌培養(yǎng)2-4h。(5)在超凈工作臺(tái)上，取適量的菌液涂在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上，28℃倒置黑暗培養(yǎng)，2-3天后可以看到轉(zhuǎn)化出的農(nóng)桿菌單菌落。1.3.19瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥(1)挑農(nóng)桿菌單菌落于LB培養(yǎng)基中，28℃搖菌。(2)OD600=1—1.5(3)離心3000rpm15min(4)棄上清，用重懸液懸起OD600=0.6—0.8(5)避光1—3h(6)侵染前加入0.03%silwet—77，混勻。(7)將擬南芥花浸泡入菌液中8s。(8)拿出甩干，保鮮膜包好，避光或弱光培養(yǎng)12h。(9)正常培養(yǎng)，10天之后再次侵染。(10)收種子，在含有抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。2.結(jié)果與分析2.1pWBVec8+Ga-b載體的酶切根據(jù)pWBVec8+Ga-b載體圖譜可知，pWBVec8+Ga-b載體含有Xba=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1專一酶切位點(diǎn)，酶切獲取13.2kbDNA片段，進(jìn)行電泳檢測(cè)并回收(圖1)。圖1載體pWBVec8+Ga-b的酶切回收。A，載體pWBVec8+Ga-b示意圖；B，載體pWBVec8+Ga-b的酶切回收后電泳檢測(cè)。2.2載體去磷酸化Xba=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1對(duì)pWBVec8+Ga-b載體酶切后會(huì)產(chǎn)生5，突出粘性末端，為了防止載體自連現(xiàn)象的發(fā)生，利用熱敏磷酸化酶進(jìn)行去磷酸化處理。去磷酸化后利用乙醇沉淀法進(jìn)行純化。2.3載體補(bǔ)平Xba=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1酶切后產(chǎn)生5，突出粘性末端，對(duì)DNA片段的連接需要堿基完全互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)于同源性低的兩片段連接率就低甚至不發(fā)生連接，為了方便連接需要對(duì)目的DNA片段在Klenow酶的作用下以dNTP為原料根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行補(bǔ)平，最終形成平末端。2.4Cas9質(zhì)粒的酶切Cas9質(zhì)粒中有一下元件依次為，35S啟動(dòng)子、NLS核定位信號(hào)序列、flag標(biāo)簽序列、基因編碼序列和終止序列，并且在35S啟動(dòng)子和最后的終止子兩側(cè)分別存在EcoR=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1和Hind=3\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"3雙酶切位點(diǎn)。利用EcoR=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1和Hind=3\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"3雙酶切后5.5kbDNA片段即是含有上述元件的片段，我們采用EcoR=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1和Hind=3\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"3雙酶切回收該片段(圖2)。圖2Cas9質(zhì)粒的酶切電泳檢測(cè)圖2.5含有Cas9元件片段的補(bǔ)平為了方便載體的連接，在Klenow酶的作用下以dNTP為原料根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則對(duì)上一步回收的酶切產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)平，最終形成平末端。2.6Cas9元件片段與載體的連接插入片段Cas9與目的載體pWBVec8+Ga-b進(jìn)行連接，將連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DB3.1感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布到含有壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單克隆搖菌并提取質(zhì)粒即為目標(biāo)載體，并標(biāo)記為pWBVec8+Ga-b-CRISPR。2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR質(zhì)粒檢測(cè)經(jīng)分析目標(biāo)載體pWBVec8+Ga-b-CRISPR含有兩處Xba=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1的酶切位點(diǎn)，如果進(jìn)行Xba=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1酶切又可以得到5.5K的片段和13.2K的片段。經(jīng)過檢測(cè)我們得到正確的重新的到插入片段Cas9和目的載體pWBVec8+Ga-b。后根據(jù)目標(biāo)載體pWBVec8+Ga-b-CRISPR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行Xba=1\#"#,##0.xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx"1單酶切，電泳檢測(cè)以驗(yàn)證所構(gòu)建的載體是否正確(圖3)。圖3pWBVec8+Ga-b-CRISPR質(zhì)粒檢測(cè)。A，載體pWBVec8+Ga-b-CRISPR示意圖；B，載體pWBVec8+Ga-b-CRISPR的酶切后電泳檢測(cè)。2.8入門載體的構(gòu)建首先對(duì)oSU6啟動(dòng)子利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增并電泳檢測(cè)(圖4A)，選擇pDONR207作為供體利用Gateway技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建。將得到的入門載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布到含有慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單克隆搖菌，利用載體上重組位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物(pDONR-F/pDONR-R)進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，正確的克隆應(yīng)該能得到約700bp的條帶，檢測(cè)正確的克隆提取質(zhì)粒備用(圖4B)。圖4入門載體的構(gòu)建。A,oSU6啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖；B,入門載體電泳檢測(cè)圖；3.討論本實(shí)驗(yàn)對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了定向改造一方面提高了轉(zhuǎn)化效率，另一方面為以后對(duì)基因組進(jìn)行人工改造提供簡(jiǎn)單便捷的途徑。在實(shí)驗(yàn)過程中我們不僅采用傳統(tǒng)的酶切、連接構(gòu)建載體，也提出利用Gateway技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建載體。Gateway技術(shù)是基于噬菌體的位點(diǎn)特異重組反應(yīng)，在目的片段添加重組位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物與含重組位點(diǎn)的供體載體混合進(jìn)行BP反應(yīng)獲得入門載體(entryclone)，入門載體可以和不同用途的目標(biāo)載體進(jìn)行LR反應(yīng)獲得相應(yīng)的表達(dá)載體，無需相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。如果已經(jīng)成功的構(gòu)建一個(gè)入門載體，就可以反復(fù)的使用它，將特異的目標(biāo)基因重組到定向改造過的表達(dá)載體上。當(dāng)目的基因在表達(dá)載體間簡(jiǎn)捷快速穿行時(shí)，保證了重組DNA片段正確的閱讀框和方向，因而不影響不同的表達(dá)克隆的測(cè)序結(jié)果。這在使用每一種新的表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，更多節(jié)省了時(shí)間。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中對(duì)比得知，傳統(tǒng)的酶切-連接技術(shù)要求嚴(yán)格，容易出錯(cuò)，酶切位點(diǎn)不易找到，成功率不高，而Gateway技術(shù)這種方法不僅簡(jiǎn)單而且成本較低，成功率高，適合實(shí)驗(yàn)室普遍推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將表達(dá)sgRNA和Cas9元件整合到同一載體中，以提高轉(zhuǎn)化效率。同時(shí)也利用改造后的定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)含有OsU6啟動(dòng)子和sgRNA的入門載體進(jìn)行改造，引入位點(diǎn)特異的20bp的序列，方便sgRNA元件序列的替換。定點(diǎn)突變技術(shù)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法向基因組或是質(zhì)粒中引入具有表征方向的變化，包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等，定點(diǎn)突變能迅速、高效的提高DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段，其中，體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是實(shí)驗(yàn)室中改造/優(yōu)化基因常用的手段[5]。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究的CRISPR/Cas9系統(tǒng)而言，再某些程度上優(yōu)于其他基因組編輯技術(shù)，但是也存在自身的不足，例如，在不同的生物中也表現(xiàn)出不同程度的脫靶效應(yīng)是目前研究領(lǐng)域需要解決的一大難題。據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明：Spacer序列的堿基組成、長度、錯(cuò)配位點(diǎn)的位置、數(shù)目和分布特點(diǎn)以及Cas9核酸酶和sgRNA的濃度等數(shù)個(gè)因素均有可能影響CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性[6-9]。現(xiàn)階段主要通過盡可能的選擇特異性較高的Spacer序列的位置、對(duì)Cas9基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以及選擇合適的sgRNA(包括計(jì)算機(jī)建模和控制sgRNA的表達(dá)量)來降低脫靶效應(yīng)。最近，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)發(fā)展極為迅速，已經(jīng)在動(dòng)物建模、作物育種、基因治療、藥物開發(fā)和工業(yè)生物工程等不同的領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用[10]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功的在擬南芥[11]、煙草[12]、水稻[13]、小麥[14]、玉米[15]、等生物中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因組編輯。針對(duì)世界上的耕地面積和可利用資源的存在狀況，培養(yǎng)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的農(nóng)作物就顯得至關(guān)重要。因此，采用最新的生物技術(shù)來進(jìn)行修飾植物內(nèi)源基因以此來提高作物的產(chǎn)量并改良作物的品質(zhì)創(chuàng)造新的途徑[16]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中也存在很多有待解決的問題：1、怎樣才能攻破PAM序列的限制2、如何設(shè)立對(duì)Cas9脫靶效應(yīng)的全面評(píng)價(jià)體系3、如何構(gòu)造在不同的物種中通用的Cas9與sgRNA導(dǎo)入與表達(dá)系統(tǒng)4、如何更高效的激活同源重組修復(fù)等[10]。然而基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的快速發(fā)展以及隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)研究的深入，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將在基因組水平的基因的改造、表觀遺傳的調(diào)控以及在轉(zhuǎn)錄調(diào)控等不同的層次上得到更為寬廣的發(fā)展與應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)就為不同物種構(gòu)建不同轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體從而發(fā)生定點(diǎn)突變提供高效，經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)單的提供可能。參考文獻(xiàn)[1]謝科，饒力群．基因組編輯技術(shù)在植物中的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景[J].中國生物工程雜志,2013，33(6):99-104.[2]Gaj,T.Gersbach,C.A.,andBarbas,C.F.,III(2013).ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsBiotechnol.31,397–405.[3]MojicaFJ,Diez-VillasenorC,SoriaE,etal.BiologicalsignificanceofafamilyofregularlyspacedrepeatsinthegenomesofArchaea,Bacteriaandmitochondria[J].MolMi-crobiol,2000,36(1):244-246.[4]WiedenheftB,SternbergSH,DoudnaJA.RNA-guidedgeneticsilencingsystemsinbacteriaandarchaea.Nature,2012,482(7385):331-8.[5]張浩.定點(diǎn)突變技術(shù)的研究進(jìn)展[J]．免疫學(xué)雜志，2000，16(4):109-110.[6]MaliP,AachJ,StrangesPB,etal.CAS9transcriptionalactivatorsfortargetspecificityscreeningandpairednickasesforcooperativegenomeengineering.NatBiotechnol,2013,31(9):833-8[