《分子醫(yī)學實驗學》實驗指導供口腔、護理、藥學各專業(yè)用（第一版）佛山科學技術學院醫(yī)學院編2008年6月編寫說明《分子醫(yī)學實驗學》是一門集生物化學、免疫學、生物化學技術和分子生物學基本實驗、科研探索和醫(yī)學應用于一體的全新的綜合性實驗課程。其實驗技術反映現(xiàn)代生物醫(yī)學發(fā)展趨勢?！斗肿俞t(yī)學實驗》是基礎醫(yī)學實驗教學的重要組成部分，是醫(yī)學各本科專業(yè)的專業(yè)基礎必修課。課程內容包括分子醫(yī)學基本實驗技術、基礎實驗及綜合和設計性實驗等部分。課程的主要目的一是強化基礎知識教育，突出基本技能訓練，是使學生能掌握分子醫(yī)學的經(jīng)典理論和基本實驗，二是培養(yǎng)學生綜合性素質，開發(fā)學生的科研潛能和創(chuàng)新思維。開設分子醫(yī)學實驗學的目的在于：1、驗證和鞏固理論知識，加深對理論知識的全面理解，加強記憶。2、通過實驗，掌握分子醫(yī)學實驗學的基本操作技術，掌握層析法,電泳法,分光光度法和生物大分子制備等常用的實驗方法的基本原理，熟悉分子醫(yī)學實驗的一般知識。3、培養(yǎng)學生觀察、比較、思考及分析問題和解決問題的能力，使學生具備一定的動手操作能力、創(chuàng)新能力培養(yǎng)學生科學、嚴謹、認真工作態(tài)度及理論聯(lián)系實際、實事求是的工作作風。本實驗指導11個實驗項目涵蓋了分子醫(yī)學實驗學中沉淀、離心、層析、電泳、分光光度測定等分子醫(yī)學實驗的基本方法，可依實驗所需時間作合理組合實驗，根據(jù)實驗條件和教學安排適時開課。實驗室規(guī)則1．實驗前必須預習實驗指導和相關理論知識，明確實驗目的、原理、預期的實驗結果、操作關鍵步驟及注意事項，計劃安排實驗工作時間。穿白大衣準時進入實驗室，保持實驗室整潔安靜，不得談笑和大聲說話，不準做與實驗無關的事情。3．實驗時應持“三嚴”作風——態(tài)度嚴謹、思維嚴密、操作嚴格。實驗中認真、仔細觀察實驗過程中的實驗現(xiàn)象和結果，及時如實的做好原始記錄。實驗失敗須重做。根據(jù)實驗結果進行科學分析，寫好實驗報告，交指導教師批閱。4．注意安全，不得擅自離開。使用易燃、易爆、有毒試劑和材料進行實驗時，應嚴格遵守操作規(guī)程，防止火災、中毒、污染、觸電等事故發(fā)生，一旦發(fā)生，果斷處理并立即報告教師愛護公物，防止損壞，若有損壞及時報告原因并登記。公用儀器就原處使用，了解使用方法及遵守操作規(guī)程，使用后必須在儀器登記本上登記并簽名。公用試劑就近量取、用畢隨時放回原處。要節(jié)約水、電、煤氣及試劑藥品6．實驗結束，洗凈器材，清整實驗室，打掃衛(wèi)生，檢查門、窗、水、電和煤氣的安全。目錄實驗一實驗室基本知識和技術（5）實驗二蛋白質濃度測定（雙縮脲法）（21）實驗三醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質（23）附：電泳技術（27）實驗四血漿清蛋白的分離純化與鑒定（35）附：層析技術（37）實驗五胰島素及腎上腺素對血糖濃度的影響（45）實驗六脫氧核糖核酸（DNA）的提取及成分鑒定（48）實驗七質粒DNA提取與純化（51）實驗八DNA重組質粒的設計與構建（54）實驗九凝集試驗（61）實驗十肝功能組合實驗（65）附1：血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定附2：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）實驗十一免疫血清的制備（71）實驗一實驗室基本知識和技術（Thebasicknowledgeandtechnologyoflab）【目的和要求】掌握各種基本的生化技術、常用儀器的分類、使用及注意事項熟悉生化實驗室規(guī)則3．清點洗刷實驗用具。【實驗內容】實驗室規(guī)則生物化學實驗各種基本技術722型分光光度計的使用實驗記錄和實驗報告【儀器、設備】1.燒杯2.試管3.刻度吸量管4.離心管5.滴管6.攪棒7.槍式移液器及其配適吸頭8.混勻器9.恒溫水浴箱10.離心機11．722型分光光度計，721型分光光度計第一部分基本知識與操作一、常用的玻璃儀器分類：常用的玻璃儀器分類有量器和容器，“量器”主要包括：量筒、量杯、容量瓶、吸管等。“容器”主要有燒瓶、燒杯、試管、試劑瓶、離心管等。量器有量入式和量出式兩種形式。“量入式”用“ＴＣ”、“Ｅ”、“λ”表示，定量標記由下往上遞增，測量注入量器中的液體；“量出式”用“TD”、“A”表示；定量標記由上而下遞增；測量從量器中傾出的液體。（二）玻璃儀器的洗滌、干燥1、洗滌液：①洗潔精，肥皂水，洗衣粉。②玻璃儀器專用洗滌液：主要成份為中性稀氯氧化劑，上海日化研究所出品2、洗滌的要求與步驟：要求：潔凈的玻璃器皿表面應不掛任何水滴。步驟：不凈的器皿洗衣粉或肥皂水刷洗自來水沖凈達到要求？是浸入洗液(數(shù)小時至過夜)自來水沖凈蒸餾水涮洗2—3次(其目的是去除自來水中的雜質，故應少量多次，全面充分)烤干或晾干、備用注意：對使用過的儀器應養(yǎng)成及時清洗的習慣，特別是血液分析時用以吸取血液樣本的吸管，用過后應當立即用水將所沾的血液沖去，否則放置過久，血液干燥硬結，就很不容易清除。①新購置的玻儀：合成洗滌劑洗刷→→0.2mol/L鹽酸浸泡（去除游離堿）２―６小時→→自來水沖洗→→ＤＳ沖洗２――３次。②一般容器：如試管、燒杯、三角燒瓶等。流水沖洗→→合成洗滌劑洗刷→→自來水多次沖洗→→ＤＳ沖洗。③容量分析儀器：如吸管、容量瓶、量筒、滴定管等。使用后立即浸泡水中。自來水多次沖洗→→瀝干→→鉻酸洗液浸泡數(shù)小時→→自來水多次沖洗→→ＤＳ沖洗２――３次。（不能刷洗）④比色杯：用畢立即用ＤＳ反復沖洗。洗不凈時，用鹽酸沖洗，再用自來水沖洗和蒸餾水沖洗。避免用堿液或強氧化劑清洗，切忌用試管刷或粗糙紙試擦3、玻璃儀器的干燥一般的玻璃儀器均可洗凈后倒置架上，讓其水分蒸發(fā)自然干燥，如需迅速干燥者應按儀器的不同類型按下述不同方法處理：①試管、離心管、燒杯、燒瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100—105℃②少量儀器如需急用也可在電爐上或酒精燈上烘烤。烘烤時應將器皿時時轉動，務使受熱緩慢且均勻，并將管口(或杯口)傾斜向下，以便水蒸氣冷凝成水滴，順口流出，不致使水滴接觸烘熱了的器壁而使儀器爆裂。③使用電吹風干燥一般玻璃儀器也很便利常用。④下列玻璃儀器應避免烘烤：各種計量玻儀：不可烘烤，自然干燥（容易造成器壁變形而致容量不準）。常用定量吸管很難自然干燥，可在８０至１００℃烘箱烤干。厚壁玻儀（研缽、量筒比色杯：等）及結構復查的玻儀：易在烘烤時發(fā)生破裂，不可烘烤，自然干燥。（自然干燥適應于不急于使用和各種計量玻儀；烘烤干燥除結構復雜、厚壁及計量玻儀外，均可。溫度在１２０℃，刻度吸管溫度應小于１００℃常規(guī)操作技術及注意（一）移液操作用于移液操作的有奧氏吸管、移液管、刻度吸管三種吸量管及槍式移液器。三種吸量管比較奧氏吸管移液管刻度吸管特點管中有一球形膨起管中有棱形膨出直筒狀只有一個刻度只有一個刻度有多個刻度準確度最高次之再次之應用適用于吸取標準液吸取標準液生化實驗中廣泛使用或粘稠性血標本管尖液吹不吹吹（完全流出式）停留15秒不吹（不完全流出式）流速愈慢愈好慢流出快流出1、吸量管的使用吸量管的選擇：·在一次完成轉移的前提下，應選用容量較小的吸量管·對于同一次實驗中同一種試劑的移取，應選用同一支吸量管②操作(見圖1—1)·用洗耳球將液體吸至超過標線·移開洗耳球，迅速用食指壓緊管口·必要時將管尖端外圍拭凈·調液面至標線·放開食指，使液體流入容器·將最后液滴沿器壁而下或吹出③讀數(shù)(見圖1—2)·吸量管保持垂直·視線與液面應水平·管中液面與刻度線應呈切線使用注意：持管方式；管尖插入液面的深度；吸液；讀數(shù)（認刻度，準確讀數(shù)，注意無色液與有色液讀數(shù)之區(qū)別）；放液（吹與不吹之分，注：對于刻度由上至下的吸量管應盡量使用上端刻度管尖殘液是否需吹出，看清標記）。2、槍式定量移液器的使用①搶式移液器的結構(見圖3)（1.液體吸放鈕2．體積選取鈕3.體積、顯示4．槍頭排放鈕5.槍頭排放器6．槍頭接嘴）其內部柱塞分2段行程，第1檔為吸液，第2檔為放液，手感十分清楚。種類：固定式和可調式規(guī)格：0.5――10000ul不等②操作(見圖1—4)·正式使用之前，要連續(xù)按動數(shù)次，使管內空氣同工作環(huán)境空氣交換，保持管內工作負壓恒定·調體積選取鈕至所需值，在移液管下端插上塑料吸嘴，輕輕扭轉以保證所密·垂直持握槍式移液器外殼，按下大拇指至第1檔·將吸嘴垂直地浸入所需取樣液內，深度為2~3毫米，徐徐松開大拇指，使之返回原來位置。·停留1――2秒，平緩地將移液管取出，同時應避免吸嘴與任何東西碰撞?！⑽鹤煲浦良訕尤萜鞅谏?，緩慢按動按手至第一檔，將液體排了。停留1秒（粘性較高的溶液停留時間可長些）。緊接著再將按手按至第二檔，排出吸嘴里的全部液體。（要求動作連）?！ね耆懦鲆后w后，小心地連同吸嘴沿著容器壁向上滑動取出?！ぴ俜潘砂词郑怪祷卦瓉砦恢?，即完成一次操作。如需移取另一樣品，按槍頭排放鈕，更換槍頭注意：·移液器是精密量取，不允許將移液器直接與液體接觸?！げ皇褂脮r也應插上塑料吸嘴，以免液體或染色液吸入移液器內，導致阻塞?！ひ迫∵^程中應控制速度，力度?！に芰衔炜山?jīng)受100℃（二）混勻操作(1)旋轉法：手持容器，使溶液作離心旋轉(2)指彈法：一手執(zhí)試管上端，另一手輕彈試管下部，：使其中液體作渦旋運動。(3)攪動法：使用玻璃棒攪邊；多用于溶解燒杯中的固體。(4)混勻器法：將試管置于混勻器的振動盤上，逐漸用力下壓，使內容物旋轉。(5)倒轉混勻：適用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞離心管等。操作時，將容器反復倒轉。試管內的液量太多，也可利用倒轉混勻法，外面包以玻璃紙塞住管口，然后用手指按住橡皮塞將試管反復倒轉，溶液即可充分混勻。(6)吸管混勻法：用吸管將溶液反復吸吹數(shù)次，以達到混勻的目的。（三）加熱與保溫操作1、加熱(見圖1~5；圖1~6)2、保溫①使用恒溫水浴箱，調節(jié)溫度設定鈕至需要的溫度。②水浴箱中水要足量。③實驗過程中應隨時監(jiān)測溫度，并及時調節(jié)。（四）離心操作離心沉淀法：當顆粒小而不均一，沉淀粘稠或容積小又需精確定量時，往往采用離心沉降法。1、離心前檢查：①取出所有套管，起動空載的離心機，看是否轉動平穩(wěn)。②檢查套管有無軟墊，是否完好，內部有無異物。③離心管與套管是否匹配。2、平衡：將一對離心管放入套管，置于天平兩側，用滴管較輕一側的離心管與套管之間加水至兩側平衡(離心管及其內溶液量不能差別過大)3、離心：將等重的兩管置于離心機中的對稱位置，調轉速調節(jié)鈕，逐漸增加轉速至所需值，計時，離心結束后，將套管中的水倒凈，所有套管放回離心機中。4、使用注意①根據(jù)需要選擇合適的轉速、時間；②選擇合適的離心管，做到對稱平衡；③啟動時應由低速慢慢加至所需速度④離心結束關機后，應讓其自然停止，不可用手或其它物品強迫停止（五）點收儀器根據(jù)儀器清單，逐項查點是否完好(如有缺損向教師聲明及時補充更換)第二部分分光光度法當光線通過透明溶液介質時，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透過，所以光線射出溶液介質之后光能被減少。對溶液來說，溶液呈現(xiàn)不同的顏色，是由于溶液中的質點(分子或離子)選擇性地吸收某種顏色的光所引起的。如果各種顏色的透過程度相同，這種物質就是無色透明的，若只讓一部分波長的光透過，其它波長的光被吸收，則溶液就呈現(xiàn)出透過光的顏色，并與被吸收的光的顏色完全互補。任何一種溶液，對不同波長的光的吸收程度是不相等的，一些有色物質可以選擇性地吸收一部分可見光區(qū)的光的能量而呈現(xiàn)不同顏色，一些物質卻能特征性地選擇吸收紫外線的能量。物質吸收由光源發(fā)出的某些波長的光可形成特定的吸收光譜。由于物質的吸收光譜與物質的分子結構有關，而且在一定條件下其吸收程度與該物質的濃度成正比，所以可利用物質的特定吸收光譜對其進行定性和定量分析。分光光度法是利用各種物質所具有的這種吸收特征所建立起來的分析方法。一、分光光度分析法的基本原理勞伯—比爾定律(Lambert-Beerlaw)是討論吸收光能與溶液濃度和溶質層厚度之間關系的基本定律，是分光分析的理論基礎。勞伯—比爾定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體（一）Lambert氏定律一束單色光通過透明溶液介質時，光能被吸收一部分，被吸收光能的量與溶液介質厚度有一定比例關系(見圖2—1)。表達式為這里I0為入射光強度I為通過溶液介質后的光強度L為溶液介質的徑長(pathlength)k為吸光系數(shù)(absorptioncoefficient)(g·cm-1)（二）Beer氏定律以溶液介質濃度變化代替溶液介質厚度的改變，光能的吸收與濃度改變有類同的關系，即一束單色光通過溶液介質時，光能被溶液介質吸收一部分，吸收多少與溶液介質濃度有一定的比例關系。得出下式：這里C(Concentration)為溶液介質的濃度(g·L-1)將Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即(1)和(2)合并為式中A(Absorbance)為吸光度T(Transmittance)為透光度(4)式也可表達為A=εCb…………..(5)式中ε(epsilon)稱之摩爾吸光率(Molarabsorptivity)(mol／L-1cm-1C(concentration)濃度(mol／L)b(pathlength)溶液樣品的長度cm(或比色皿內徑長cm)(5)式為lambert—Beer定律的物理表示式，其含義為一束單色光通過溶液介質后，光能被吸收一部分，吸收多少與溶液的濃度和厚度成正比。此式為分光分析法的基本計算式。如果實驗中溶液厚度b=lcm則A=εC圖2—2表明，在溶液介質厚度一定的情況下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介質濃度(C)之間的關系。摩爾吸光率(ε)實際上是物質在單位濃變和單位厚度下對入射光的吸光度，在一定波長下，ε越大表示物質對光的吸收越強。二、分光光度法的定性定量方法許多對光有吸收的物質可以直接用分光光度法進行定量分析：一些對光，包括紫外、可見或近紅外都無吸收的物質亦可通過和某些化學試劑作用而呈色，在一定的反應條件下和一定的濃度范圍內，溶液顏色的深淺(對光吸收的程度)和該溶液中顯色物質的濃度呈正比。(一)測定波長的選擇使用分光法測定溶液中物質的含量，首先要選擇最適單色波長，因為只有以能被溶液吸收的光束作為入射光才能符合Lambert—Beer定律。測定有色物質時，不同顏色的待測溶液，則應選擇不同波長的單色光束。在分光光度計上，單色光波長的選擇原則一般是使被測溶液的單位濃度的吸光度變化最大，同時還要具有最小的空白及干擾讀數(shù)，借以獲得最高的靈敏度和正確性。最理想的辦法是對每種物質的測定都應先傲它的光譜吸收曲線及有關干擾物的吸收曲線，根據(jù)這些光譜吸收曲線來選擇最佳測定波長。表2—2可供波長選擇的參考。(二)分光光度法定量方法1、利用標準管計算測定物含量最適波長選定以后可進行溶液物質含量的測定。通常都采用對比測定法，即以巳知精確含量的待測物質的溶液作為參考標準物(Cs)和未知待測樣品(Cx)用同一方法，在同一條件下、同時進行測定，讀取標準物質的吸光度(As)和未知含量的樣品吸光度(Ax)，由于標準物質和未知物質是同一物質，其摩爾吸光率(巨)相同和進行測定用的比色皿內徑長(b)相同即bs=bx，根據(jù)A=εCb式，可得到As=Cs換算成下式Ax=Cx式中Cs是標準管中物質的實際含量，是標準液的濃度與實際用量的乘積；Cx是測定管中物質的實際含量。還應換寫到法定單位mmol／L、mg／m1。2、利用標準曲線進行換算配制一系列不同濃度的標準的溶液(至少五個)按測定管同樣方法處理顯色，在選定的波長分別測定各管的吸光度(A)，以吸光度為縱坐標，標準溶液的濃度(C)為橫坐標，在方格坐標紙上作圖，制作標準曲線。以后在同樣條件下進行測定時，測定被測溶液的吸光度，從標準曲線上可找出相應的濃度。根據(jù)Lambert—Beer定律，標準液的濃度在一定范圍內與吸光度呈直線關系，標準曲線是這種直線關系的描述，一般認為，標準曲線范圍在測定物濃度的一半到二倍之間，并使吸光度在0．05—1．0范圍內為宜。還須注意：曲線制作與測定管的測定應在同一儀器上進行，由于曲線的建立與實驗室當時的條件如溫度，濕度和氣壓及電壓穩(wěn)定性等有關，因此標準曲線常因各種變化而需校正或重做。3、摩爾吸光率ε求取測定物濃度當濃度為1M／L時，溶液厚度為1cm，吸光率用ε表示，在已知測定物的ε，則可根據(jù)下式求得測定物的物質濃度。此計算法常用于紫外吸收，如核苷酸溶液含量測定，如UTP在262nm具有最大吸收峰，利用已知UTP在262nm時的摩爾吸光率ε，讀取待測UTP溶液吸光度A，即可求出該UTP濃度。二種以上被測物的混合液，也可利用不同ε進行定量測定。例如a，b兩種物質在波長λ1時，摩爾吸光率分別為εa1和εb1：，在波長λ2時摩爾吸光率分別為εa2和εb2，a和b混合的溶液在λ1時吸光度為Al，在λ2時的吸光度為A2(圖2—3)，各自濃度分別為Ca和Cb，則如有三種以上成分的混合液，也可通過三種不同波長情況下的吸光度，以各自特有的ε值，依據(jù)三元一次方程，同樣可求出未分離的三種混合物的各自濃度-‘（三）、物質的定性分析以不同波長的單色光作為入射光，測定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波長為橫軸，各相應的吸光度為縱軸作圖，可得到溶液的吸收光譜曲線。吸收光譜曲線是物質的特征性曲線，它和分子結構有嚴格的對應關系故可作為定性分析的依據(jù)。不同的物質，分子結構不同，其吸收光譜曲線也有其特殊形狀(圖2—4)。在吸收光譜中，往往可以找到一個或幾個吸收最大值，該處的波長稱為最大吸收波長(入max)。物質不同，它們的波長(nm)最大吸收波長也往往不同，圖1—4為維生素B12溶液的吸收光譜曲線。物質用分光分析定性主要依據(jù)吸收光譜存在的特征吸收。①比較吸收光譜曲線，在相同情況下，吸收光譜曲線不同，表明物質的化學結構不同，因為不同的物質有各自的特征性曲線。如ATP和GTP都屬于核苷酸，它們的溶液在紫外光區(qū)均有吸收，但由于化學結構不很一樣，它們的吸收光譜就有差別。需要注意的是在不同條件(如選擇不同溶劑)下，即使是同一物質也可呈現(xiàn)不同的吸收光譜。②比較最大的吸收波長。不同的物質可有不同的最大吸收波長(kmax)。如ATP、GTP、CTP和UTP的λmax分別為259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax可作為物質定量測定的最適波長，此時測定靈敏度最高。有些物質化學結構相近，可產(chǎn)生相同的λmax，伹它們的吸收系數(shù)都不一致，可據(jù)此鑒別之。③比較吸光度比值?？筛鶕?jù)物質兩個或幾個不同波長的吸光度比值來鑒別不同的物質，同時也可檢查物質的純度。如DNA溶液kmax為260nm。在260nm的吸收度和在280nm的吸收度比值為1．8。但溶液中混進了蛋白質，則比值會降低(蛋白質在280nm處有最大吸收)。三、分光光度計基本結構與使用分光光度計的類型很多，最常用的是可見分光光度計和紫外—可見分光光度計。各種類型的分光光度計的結構和原理基本相同，一般包括光源、單色器、比色杯、檢測器和顯示器幾大部分。光源單色器狹縫吸收杯檢測器顯示器鹵鎢燈濾光片玻璃杯將光信號檢流計氫燈棱鏡石英杯轉換為電信號微安表光柵（光電管和數(shù)字顯示器光電倍增管）（一）光源一個良好的光源要求具備發(fā)光強度高、光亮穩(wěn)定、光譜范圍廣和使用壽命長等特點?？梢姽夥止夤舛扔嫵Ｓ玫墓庠词遣捎梅€(wěn)壓調控的鎢燈(tungstenlamp)，能發(fā)射出350nm~2500nm波長范圍的連續(xù)光譜，適用于340-900nm范圍的光源?，F(xiàn)在常用的鹵鎢燈。紫外光光度常用氫燈(hydrogenlamp)作光源，其發(fā)射波長的范圍為150nm~400nm。它適用于做200-360nm的紫外分光分析。（二）單色器將來自光源的復合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。分光光度法測定某一物質的吸光度需要在某一特定波長下進行，單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長范圍的單色光。在實際工作中欲選擇出單個某波長的光線是困難的。所謂單色光是指在此波長有最大發(fā)射，而在相鄰較長和較短波長范圍內的發(fā)射能量較少而言。單色光的波長范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，測量的結果愈可靠。單色器可分為濾光片、棱鏡和光柵。濾光片可分為吸收濾光片、截止濾光片、復合濾光片和干涉濾光片。棱鏡是用玻璃或石英材料制成的一種分光裝置。其原理是利用光從一種介質進入另一種介質時，光的波長不同在棱鏡內的傳播速度不同，其折射率不同而將不同波長的光分開。見圖2—4通過單色光器的發(fā)射光的強度可能過強也可能過弱不利于進一步檢測。狹縫是由一對隔板在光通路上形成的狹縫。通過調節(jié)狹縫的大小來調節(jié)入射單色光強度并使入射光形成平行光線，以適應檢測器的需要。光電比色計的狹縫是固定的，而光度計和分光光度計的狹縫大小是可調的。（三）比色杯比色杯又吸收杯，是光度測量系統(tǒng)的最重要部分之一。在可見光范圍內測量時選用光學玻璃吸收杯，在紫外線范圍內測量時要選用石英吸收杯。比色杯的光徑0.1~10cm，一般為1cm。注意保護比色杯的質量是取得好的分析結果的重要條件之一。不得用粗糙、堅硬物質接觸吸收杯，不能用手指握取吸收杯的光學面；用后要用水及時沖洗，不得殘留測定液，尤其是蛋白質和核酸溶液。（四）檢測器硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來作為受光器，將通過比色杯的光信號轉變成電信號。進一步再用適當?shù)姆椒y量所產(chǎn)生的電流。（五）顯示器顯示器是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。常用的顯示器是有檢流計、微安表、記錄器和數(shù)字顯示器。四、幾種常用的國產(chǎn)分光光度計（一）72—1型分光光度計該機光譜范圍在360—800nm(可見光區(qū))，該機靈敏度較高，而且結構簡單，操作方便，可用于有色物質溶液的測定。1、72—1型分光光度計光路圖和外形圖2、使用方法①開啟電源，指示燈亮，選擇開關置于“T”，波長調置測試用波長。儀器預熱20分鐘。②打開試樣室蓋(光門自動關閉)。調節(jié)“0”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00．0”蓋上試樣室蓋，將比色皿架處于蒸餾水校正位置，使光電管受光，調節(jié)透光率“100％”旋鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”。③將選擇開關置于“A”。調節(jié)消光零旋鈕，使得數(shù)字顯示為“．000”，然后將被測樣品移入光路，顯示值即為被測樣品的吸光度的值。④如果大幅度改變測試波長時，在調整“0”和“100％”后稍等片刻，(因光能量變化急劇，光電管受光后響應緩慢，需一段光響應平衡時間)，當穩(wěn)定后，重新調整“0”和100％即可工作。⑤每臺儀器所配套的比色皿，不能與其它儀器上的比色皿單個調換。⑥換一波長測試時，應將選擇開關置“T”，重復(2)和(3)操作。⑦測試完畢，關閉開關，電源，將比色皿沖洗干凈。(三)UV—75—4型紫外分光光度計1、UV—754紫外分光光度計光路圖：由光源發(fā)出的連續(xù)輻射光線，經(jīng)濾光片和球面反射鏡至單色器入射狹縫處聚焦成像，光束通過入射狹縫，經(jīng)平面反射鏡到準直鏡，產(chǎn)生平行光射至光柵。在光柵上色散后，又經(jīng)準直鏡聚焦在出射狹縫上成一連續(xù)光譜，由出射狹縫射出——定波長的單色光，通過標準溶液再照射到光電管上。光源切換與波長移動相對應‘200nm--290nm需點亮氘燈290nm一360nm需同時點亮氘燈和鎢燈360nm--850nm需點亮鎢燈單色器采用自準式系統(tǒng)，衍射光柵使用該廠自制1200條／nm的復制閃躍光柵2、測試準備(1)打開電源開關之前，檢查一下測試樣品室。(2)試樣槽置“參考”位置。(3)打開電源開關。如果波長工作在200nm一300nm時需按氘燈觸發(fā)按鈕。(4)顯示器顯示"754”后，數(shù)顯為“100．0”，則表明儀器已通過自檢程序。此時按A／C鍵，儀器自動進入“0．000"(5)儀器預熱三十分鐘。3、測試(1)數(shù)顯“0．000"穩(wěn)定后，即可把試樣槽置于“樣品”位置進行測試(即拉一下樣品室滑桿)。待第一個數(shù)據(jù)自動打印完畢后，再可將試樣槽置于第二個“樣品”位置測試(即再拉一下樣品室滑桿)。(2)每當需要調換波長時，必須把試樣槽置于“參考”位置，重新調零，現(xiàn)將測試操作順序如下：注意：樣品號超過99號，打印數(shù)復位至00繼續(xù)計數(shù)下去。(四)分光光度計和紫外分光光度計使用注意事項①．光度計的光電管或光電池對不同濃度的光敏度不一樣，應注意每換一次波長，即應將空白溶液的吸光度調整到0。②．溶液定量測定，應注意吸光度在0．05—1．0范圍，濃度太大時應該適當稀釋。③．一般靈敏度旋鈕調置“1”檔，因其放大倍率最小，較穩(wěn)定。第三部分實驗記錄和實驗報告實驗記錄是實驗結果和經(jīng)驗的綜合記載，是分析實驗結果和書寫實驗報告的依據(jù)。而實驗報告是全部實驗的根據(jù)和總結。兩者都十分重要。學生應備有實驗記錄本和實驗報告本一、實驗記錄1．書寫整潔、字跡清楚2．記錄實驗中觀察到的實驗現(xiàn)象、實驗結果和實驗數(shù)據(jù)。原始記錄必須真實、客觀、準確、祥細、清楚，切不可夾雜主觀因素3．實驗中使用的儀器類型、試劑規(guī)格、化學反應、分子式及濃度，都應記錄清楚4．完整的實驗記錄應包括日期、實驗項目、目的要求、操作和結果等二、實驗報告實驗結束后，應及時整理實驗記錄，總結實驗結果，寫出實驗報告。實驗報告應包括以下項目：(1)實驗名稱(2)目的和要求(3)原理(簡述實驗的基本原理)(4)操作(可以采用流程圖的方式或以表格方式表示)(5)結果與討論描述實驗出現(xiàn)的現(xiàn)象和結果，分析它們所說明的問題，探討實驗成敗的關鍵。闡述對實驗設計的改進意見等。對于定量實驗列出算式進行計算并對實驗結果進行必要的說明和分析。(6)思考題實驗二蛋白質濃度測定（雙縮脲法）【目的和要求】掌握本實驗方法的原理和操作掌握標準工作（A—C）曲線的制作熟悉蛋白質定量測定的幾種常用方法【實驗內容】1．分光光度計的使用2．標準曲線的繪制3．血清蛋白質含量測定【試劑與器材】1．6mol／L氫氧化鈉溶液稱取氫氧化鈉(NaOH，優(yōu)級純)240g，用新鮮蒸餾水配制成1L，置室溫貯存在密封的聚乙烯瓶里。

2．雙縮脲試劑稱取未失結晶水的硫酸銅(CuSQ·5H20)3．0g，溶于500m1新鮮蒸餾水中，加酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6。4H2O)9．0g，碘化鉀(KI)5．0g，待安全溶解后，加入6mol／L氫氧化鈉溶液100ml，最后加蒸餾水至1L。室溫貯存在密閉的聚乙烯瓶里，約穩(wěn)定6個月。

3．蛋白標準液可用商品血清蛋白標準液或定值質控血清為標準。亦可收集混合新鮮血清，用凱氏定氮法標定后，加疊氮鈉防腐(疊氮鈉的終濃度0．5~1．0g／L)，冰凍保存。

4．恒溫水浴箱、722（721）分光光度計、吸管、試管、坐標紙【實驗原理】測定蛋白質的定量方法有很多，目前常用的有凱氏定氮法；比色法主要包括雙縮脲法、Folin-酚試劑法及染料結合法；紫外分光光度法等雙縮脲(Biuret)法：在堿性溶液中，雙縮脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物，這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(—CO—NH2)，或與此相似的基團[如—CH2—NH2，—CS—NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應。蛋白質分子含有眾多肽鍵(—CO—NH—)，可發(fā)生雙縮脲反應，且呈色強度在一定濃度范圍內與肽鍵數(shù)量即與蛋白質含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。與同樣處理的蛋白標準液比較，經(jīng)計算或查標準曲線即可求出血清總蛋白質含量?！静僮鳌?.配制20g／L蛋白標準液

如蛋白標準液濃度為70g／L，則取此液2m1，加入新鮮蒸餾水5ml，混勻即成。2.按表操作加入物（ml）空白管12345測定管20g/L蛋白標準液～0.10.20.30.40.5～蒸餾水0.50.40.30.20.1～0.4待測樣品液體～～～～～～0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當血液蛋白質（g/L）～20406080100混勻，置37℃水浴10min(或25℃30min)，用3、標準曲線繪制1—5為標準曲線管，測得吸光度后，以吸光度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標繪制標準曲線。4、實驗結果根據(jù)測定管吸光度，從標準曲線查找相對應的總蛋白濃度?！咀⒁馐马棥?．雙縮脲試劑中，加入酒石酸鉀鈉，Cu2+形成穩(wěn)定的絡合銅離子，以防止CuSO4·5H20不穩(wěn)定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸鉀鈉與CuSO4·5H20之比不低于3：1，加入KI作為抗氧化試劑。2．雙縮脲試劑要封閉貯存．防止吸收空氣中的二氧化碳。3．本法各種蛋白質的顯色程度基本相同，重復性好，幾乎不受溫度影響，唯一缺點是靈敏度較低。4．黃疸血清．嚴重溶血對本法有明顯干擾。5．本法繪制的標準曲線是一條通過原點的直線，在100g/L濃度之內呈良好的線性關系。思考題：1．雙縮脲法測定蛋白質的原理是什么?其他還有什么方法測定蛋白質的含量?2．請用雙縮脲法，設計一個測定蛋白質含量的定量方法(除標準曲線法外)。實驗三醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(Serumalbuminseparatedbyacetatefilmelectrophoresis）【目的和要求】1．掌握醋酸纖維素薄膜電泳的原理和操作方法了解醋酸纖維素薄膜電泳所分離的血清蛋白質的各帶譜及其臨床意義。【實驗內容】血清蛋白質電泳—醋酸纖維薄膜法儀器和薄膜的準備點樣平衡和電泳染色結果判斷透明定量分析【器材】1．儀器：電泳儀、電泳槽、分光光度計或光密度儀。

2．材料：醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、點樣器、直尺、鉛筆、剪刀等。【試劑】1．巴比妥—巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06)。稱取巴比妥2.21克和巴比妥鈉12.36克，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解。待冷至室溫后，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。⑴麗春紅S染色液：稱取麗春紅SO.4g、三氯醋酸6g，用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。⑵氨基黑10B染色液：稱取氨基黑（C22H13O12N6S3Na3）10B0.1g,溶于20ml無水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解。另取磺基水楊酸2.5g，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻，再以蒸餾水補足至100ml。稱取麗春紅S0.4克及三氯醋酸6克；用蒸餾水溶解，并稀釋至3．漂洗液。（1）3％（V／V）醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。（2）甲醇45ml、冰醋酸5ml、蒸餾水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗。4．透明液取無水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用。

5．洗脫液（1）0.1mol/LNaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。（2）0.4mol/LNaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫。6．40%(V／V)醋酸溶液?！緦嶒炘怼繋щ姾傻牡鞍踪|，在電場中向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動稱為電泳。血清中各種蛋白質的等電點不同，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質均帶負電，在電場中都向陽極移動。由于各種蛋白質在同一pH環(huán)境中所帶負電荷多少及分子大小不同，所以在電場中向陽極泳動速度也不同。蛋白質分子小而帶電荷多者，泳動速度快；反之，則泳動速度慢。因此可將血清蛋白質依次分為清蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶，經(jīng)染色可計算出各血清蛋白質含量的百分數(shù)。以醋酸纖維薄膜（CAM）為支持介質，電泳分離后經(jīng)染色處理，可展示出清晰的蛋白質電泳圖譜。由于染色時染料與蛋白質的結合與蛋白質的量成正比，因此將各蛋白質帶剪下，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫下來，即可進行比色，測定出各蛋白質區(qū)帶的相對含量。也可用一定量的有機溶劑使CAM溶解制成透明膜而用光密度計進行掃描定量。醋酸纖維薄膜電泳具有微量、快速、簡便及分辨率較高等優(yōu)點，廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、同工酶的分離和測定?！静僮鳌?、電泳槽的準備將巴比妥－巴比妥鈉緩沖液加入電泳槽中（兩側槽內注入等量的緩沖液），調節(jié)兩側內的緩沖液，使其在同一水平面，液面與支架的距離約為2～2.5cm。支架寬度到恰好適合CAM的長度，用3～4層濾紙或42、CAM準備取醋纖薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的無光澤面（涂有醋酸纖維素）距一端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃一線（與CAM的長軸垂直），作點樣標記，將膜條編號后將無光澤面朝下浸入巴比妥－巴比妥鈉緩沖液中，待充分浸透后取出（一般約需求20～30min）,夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.3、點樣用血清加樣器將3－5ul無溶血的新鮮血清均勻地點在劃線處，樣品應與膜的邊緣保持一定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區(qū)帶變形。待血清滲入膜后移開點樣器。點樣應注意，要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。4、平衡將已點樣的薄膜加樣面朝下，點樣端置于陰極端，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直，橋的另一端垂入緩沖液中，鹽橋將膜的兩端與緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳。5、電泳正確聯(lián)接電泳槽與整流器對應的正負極，點樣側接負極，另一側接正極。開啟電源通電。調節(jié)電壓10V～15V/cm膜長,電流0.4～0.6mA/cm膜總寬，電泳40－60分鐘（通常夏季需45min,冬季需60min），待電泳區(qū)帶展開3.5cm～4cm時即可關閉電源。6、染色通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中，染色5～10分鐘。7、漂洗至少準備3～4個漂洗皿，裝入漂洗液。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復漂洗，直至背景漂白為止。此時清晰可見5條色帶。待干。7、定量（1）洗脫比色法取六支試管，分別標明“A、α1、α2、β、γ、空白”。將漂洗凈的薄膜剪下各區(qū)帶放入相應的試管內，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，根據(jù)染色不同按以下方法洗脫。①氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內加入0.4mmol/LNaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振搖數(shù)次，置37℃水浴20分鐘，使色澤完全浸出。用620nm波長，以空白管調零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2②麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液，加入量同上。10分鐘后，于清蛋白管內加入40％（V／V）醋酸0.6ml，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉，使溶液色澤加深。如出現(xiàn)沉淀，可離心取上清液比色。用520nm波長，以空白管調零，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2。（2）光密度掃描法1）透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中3～5分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上（應無氣泡），直立片刻除去過多的透明液。于90～100℃烘箱內烘烤5～10分鐘，取出冷卻至室溫。此法透明的CAM2）掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動光密度計或其它光密度掃描的光路，選擇波長520nm，描記各蛋白區(qū)帶峰，并計算各蛋白成分的相對含量。8、計算定量計算時，先計算各光密度值的總和：再計算血清各部分蛋白質所占的百分率吸光度總和（T）＝2A＋α1＋α2＋β＋γ（吸光度）Ax血清各蛋白組分的相對百分數(shù)＝―×100％ATAx表示各球蛋白組分（2A＋α1＋α2＋β＋γ）的吸光度。2AβA％＝――×100％β＝――×100％TTα1γα1％＝――×100％γ％＝――×100％TTα2α2％＝――×100％T各組分蛋白百分數(shù)(%)×血清總蛋白g/L各組分蛋白質含量（g/L）＝1009、臨床意義（1）血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：蛋白質組分g/L占總蛋白百分比(%)白蛋白35～5257.0～68.0α1球蛋白1.0～4.01.0～5.7α2球蛋白4.0～8.04.9～11.2β球蛋白5.0～10.07.0～13.0γ球蛋白6.0～13.09.8～18.2（2）臨床意義電泳圖譜可為臨床疾病診斷提供依據(jù)。腎病型可見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，α2和β升高；肝硬化型可見于慢性活動性肝炎、肝硬變等，圖型表現(xiàn)為Alb降低，β和γ增高，可出現(xiàn)β與γ難以分離而連接在一起的“β－γ”橋，此現(xiàn)象是由于肝臟纖維增生導致IgA增高所致；急性反應時相型常以α1、α2增高為特征；慢性炎癥型則以Alb降低，α2、γ增高較為常見；M蛋白血癥主要見于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質（主要是IgG或IgA），電泳時可在β和βγ之間出現(xiàn)一條峰形狹窄的區(qū)帶，稱M區(qū)帶?！咀⒁馐马棥客姇r，不得接觸槽內的緩沖液或CAM，以防觸電。每次電泳時應交換電極以使兩側電泳槽內緩沖液的正負離子相互交換，以使緩沖液的PH維持在一定水平。3．電泳緩沖液的液面要保持一定的高度，過低可能會出現(xiàn)γ球蛋白的電滲現(xiàn)象（γ球蛋白向陰極移動），同時電泳槽兩側的液面應保持在同一水平，否則，通過薄膜時有虹吸現(xiàn)象，將會影響蛋白質分子的泳動速度。4．電泳失敗或圖譜不理想的常見原因（1）電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分不佳：點樣過多；點樣不均勻、不整齊；薄膜過濕，樣品擴散；點樣速度太慢，薄膜表面局部干燥或薄膜未完全浸透或溫度過高致使膜面局部干燥或水分蒸發(fā)；緩沖液變質；電泳時薄膜放置不正，歪斜、彎曲，與電流方向不平行；樣品不新鮮；電流過低；CAM質量不好，薄膜結構過分細密，透水性差，導電差等。（2）染色后白蛋白中間著色淺：染色時間不夠或染色液陳舊；白蛋白含量過高，可減少血清用量或延長染色時間。（3）電泳速度慢：電流過低；供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過薄；溫度過低；薄膜結構過分細密，透水性差，導電差；緩沖液水分蒸發(fā)，致使離子強度增大。（4）薄膜透明不完全：透明液陳舊；浸泡時間不足；烘箱溫度未到90℃5．染料問題：各種染料對血清各組分有不同的親和力，大多數(shù)染料對白蛋白的親和力大于球蛋白。如氨基黑10B對球蛋白的結合力為白蛋白的80％，因此常導致白蛋白結果偏高，球蛋白偏低。用麗春紅S染色，效果優(yōu)于氨基黑10B。麗紅是一種指示劑，PH＜10時呈紅色，PH＞12.5時呈紫色。在酸性溶液中它的最大吸收峰在523nm左右，呈對稱性。在血清蛋白正常濃度范圍內，麗春紅S能與各蛋白質組分成正比例結合，而氨基黑10B則對白蛋白染色過深，區(qū)帶中容易出現(xiàn)著色不全的小點，不夠理想。6．樣品要求點在粗糙面（無光澤面），否則樣品很難吸入膜內。電泳時最好將點有樣品的一面朝下，以防電泳過程中水分蒸發(fā)，影響電泳結果。7．標本應新鮮，不得溶血。溶血標本會使β球蛋白假性升高，因血紅蛋白電泳位置在β球蛋白區(qū)域內。思考題1．血清蛋白在醋酸纖維薄膜上可分成5條區(qū)帶，每條區(qū)帶是否分別只代表一種蛋白質?2．用什么方法可證明醋酸纖維薄膜有無電滲作用?3．電場強度愈高血清蛋白在醋酸纖維薄膜上的泳動率愈高，是否電場愈高愈好?附注：電泳技術帶電粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳(Electrophoresis)，電泳技術是生物化學與分于生物學中的重要研究方法之一。利用電泳技術可分離許多生物物質，包括氨基酸、多肽、蛋白質、脂類、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物質的純度和分子量的測定等。電泳按介質狀想來分，有自由電泳和區(qū)帶電泳兩大類。前者以溶液為介質，在溶液中將蛋白質分離開來。兩者相比較，自由電泳過程中擴散嚴重，分辨率有限，而且設備昂貴，操作繁瑣，現(xiàn)在已基本上被區(qū)帶電泳法所取代。所謂區(qū)帶電泳法，就是在固體支持物上所進行的電泳。50年代以來，常用的固體支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、淀粉凝膠、瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等等。區(qū)帶電泳法分辨率很高，而且設備簡單，操作方便，已經(jīng)是生物化學及分子生物學領域中極為有用的技術。一、電泳法的基本原理在酸性溶液中，蛋白質分子帶正電，而在堿性溶液中，蛋白質分子帶負電。伹是這并不是實際的電動單位，從物理化學的原理來分析，帶電分子的周圍由相反電荷的離子形成擴散雙電層，它由緊密層和擴散層兩部分構成。緊密層中相反電荷的離子被束縛在大分子周圍，它在電場中是隨大分于一起泳動的，而擴散層中相反電荷的離子雖然也受到大分子的靜電引力，但在電場中卻會向另一極移動。緊密層表面相對于溶液本體的電位差稱之為電動電位即ζ(Zeta)電位，由它決定了蛋白質分子在電場中的運動速度。蛋白質泳動分子在電場中受到電動力F的驅動，其大小等于凈電荷Q和電場強度E的乘積：F=QE如果假設泳動分于為球體，它在電場中泳動時也受到一定的阻力F’，按Stoke定律，其大小與球體半徑r，介質粒度刁以及泳動速度成正比：F’=6πrηv當恒速泳動時，電動力F與阻力F’相等，即QE=6πrηv帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度，稱為遷移率(mobility)或泳動度，以μ表示，即：所以可見，一個帶電粒子的遷移率不僅取決于其本身所帶的電荷，還與帶電粒子的大小、介質的粘度等多種因素有關。在具體實驗中，式中：v為粒子的泳動速度(厘米／秒或分)，E為電場強度或電勢梯度(伏／厘米)，d為粒子移動距離(厘米)，l為支持物的有效長度(厘米)，u為加在支持物兩端的實際電壓(伏)，1為通電時間(秒或分)。故遷移率(或泳動度)的單位為厘米2·秒-1·伏特-1。假設物質1和物質2在同一電場中移動距離分別為：經(jīng)過時間t之后，兩物質(帶電粒于)移動的距離之差力：這就是說，物質1和2能否分離開來，取決于兩者的遷移率。若它們的遷移率相同則不能分離，有差別才能分離，差別越大，分離越好。當然，也與其它實驗條件有關。二、影響電泳的因素電泳結果可受到多種因素的影響，但通常認為以下4個方面更為重要。(一)電泳介質的pH當氨基酸為被分離物質時，各種氨基酸有不同的等電點，當介質的pH等于某氨基酸的等電點時，則該氨基酸處于等電狀態(tài)，即不向正極或負極移動，當介質pH小于等電點時，氨基酸呈陽離子狀態(tài)、向負極移動，反之當介質pH大于等電點時，氨基酸呈陰離子狀態(tài)，向正極移動。當20種氨基酸的混合物置于pH5．5左右的介質中電泳時，可以將它們分離為三組。蛋白質由氨基酸組成，也具有兩性電離性質，所以介質的pH值也影響蛋白質的電離情況，即決定蛋白質的帶電量(Q)。為了保持介質pH的穩(wěn)定性，常用一定pH的緩沖液，如分離血清蛋白質常用pH8．6的巴比妥緩沖液或三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液。(二)緩沖液的離子強度離子強度如果過低緩沖液的緩沖容量小，不易維持pH恒定；離子強度過高，則降低蛋白質的帶電量(壓縮雙電層降低Zeta電勢)，使電泳速度減慢，所以常用離子強度為0．02—0．2之間。溶液中離子強度的計算方法如下：Ci=離子的摩爾濃度Zi=離子的價數(shù)例1，兩個單價離子化合物(如NaCl)的離子強度等于它的摩爾濃度，如0．154mol／LNaCI溶液的離子強度例2，兩個兩介離子化合物(如ZnSO4)的離子強度等于它的摩爾濃度的4倍，如0．1mol／LZnSO4溶液的離子強度由上述例子中可以看出多價離子會使離子強度增高，所以電泳緩沖液常用單價離子的化合物配制。(三)電場強度實驗所用電場強度對移動距離起正比作用。電場強度以每一厘米的電勢差計算，也稱電勢梯度。以濾紙電泳為例，濾紙長15厘米，西端電勢差為150伏特，則電場強度為10伏特／厘米。電場強度愈高，則帶電粒子的移動愈快。伹電壓愈高，電流也隨之增高，產(chǎn)生的熱量也增加。所以在高壓電泳(電場強度大于50伏特／厘米)常需加用冷卻裝置，否則熱量可引起蛋白質等物質的變性而不能分離，還因發(fā)熱引起緩沖液中水分蒸發(fā)過多，使支持物(濾紙、薄膜或凝膠等)上離于強度增加，以及引起虹吸現(xiàn)象(電泳缸內液體被吸到支持物上)(四)電滲在電場中，液體對于固體的固定相的相對移動，稱為電滲（圖2-6）。如濾紙中含有羥基而帶負電荷，與紙相接觸的水溶液帶正電荷，液體便向負極移動。由于電滲現(xiàn)象往往與電泳同時存在，所以帶電粒子的移動距離也受電滲影響，如電泳方向與電滲相反，則實際電泳的距離等于電泳距離減去電滲的距離。如方向相同，則實際電泳距離等于電泳距離加上電滲的距離。瓊脂中含有瓊脂果膠(agaropetin)，其中含有較多的硫酸根，所以在瓊脂電泳時電滲現(xiàn)象很明顯，許多球蛋白均向負極移動。除去了瓊脂果膠后的瓊脂糖用作凝膠電泳時，電滲大為減弱。電滲所造成的移動距離可用不帶電的有色染料或有色葡聚糖點在支持物的中心，以觀察電滲的方向和距離。三、區(qū)帶電泳的分類區(qū)帶電泳的形式繁多，分類比較困難，僅按某一特點分類似乎都不全面。這里基于支持物的物理性狀、裝置形式、pH值的連續(xù)性等不同，可分為：(一)按支持物的物理性狀不同，區(qū)帶電泳可分為1．濾紙及其他纖維(如醋酸纖維紗、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維)薄膜電泳。2．粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳。3．凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳。4．絲線電泳，如尼龍絲、人造絲電泳。(二)按支持物的裝置形式不同，區(qū)帶電泳可分為1．平板式電泳，支持物水平放置，是最常用的電泳方式。2．垂直板式電泳，板狀支持物，在電泳時，按垂直方向進行，聚丙烯酰胺凝膠常做成垂直板式電泳。3．連續(xù)液動電泳，首先應用于紙電泳，將濾紙垂直豎立，兩邊各放一電極，溶液自頂端向下流，與電泳方向垂直，以后有用淀粉、纖維素粉、玻璃粉等代替濾紙分離血清蛋白質，分離量較大。4．圓盤電泳(discelectrophoresis)。電泳支持物灌制在兩通的玻璃管中，被分離的物質在其中泳動后，區(qū)帶呈圓盤狀。如果用石英玻璃制成內徑為25或50um、長50—100cm的管狀，則成為目前認為比較先進的毛細管電泳技術，若管中注入聚丙烯酰胺凝膠(特殊技術)，也是區(qū)帶電泳的一種。它集電泳與分析檢測系統(tǒng)于一身。因管細、散熱快，電壓可達2-3萬伏，故具有量微、快速、重復性好、分辨率高及可自動化等優(yōu)點，但價格很高。(三)按pH的連續(xù)性不同，區(qū)帶電泳可分為1．連續(xù)pH電泳，即整個電泳過程中pH保持不變，常用的紙電泳，醋酸纖維薄膜電泳等屬于此類。2.非連續(xù)pH電泳，緩沖液和電泳支持物間有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳分離血清蛋白質時常用這種形式，它的優(yōu)點易在不同pH區(qū)之間形成高的電位梯度區(qū)，使蛋白質移動加速壓縮為一極狹的區(qū)帶而達到濃縮的作用。但聚丙烯酰胺凝膠電泳分離核酸則采取連續(xù)pH裝置。近年來發(fā)明的等電聚焦電泳(Electrofocusing)可稱為非連續(xù)pH電泳，它利用人工合成的兩性電解質(商品名ampholin，一類脂肪族多胺基多羧基化合物)在通電后形成一定的pH梯度。被分離的蛋白質停留在各自的等電點而形成分離的區(qū)帶，電極兩端，一端是酸，另一端是堿。等速電泳Isotachophoresis)也是屬于非連續(xù)pH電泳，它的原理是將分離物質夾在先行離子和隨后離子之間，通電后被分主物質的電泳速度相同，所以叫等速電泳。近年發(fā)明的塑料細管等速電泳儀，可以進行毫微克量物質的分離，該儀器采用數(shù)千伏的高電壓，幾分鐘內即完成分離，用自動記錄儀進行檢測，它的出現(xiàn)是電泳技術的革新。四、電泳技術的應用電泳技術主要用于分離各種有機物(如氨基酸、多肽、蛋白質、酶、脂類、核苷、核苷酸、核酸等)和無機鹽。也可用于分析某種物質純度，還可用于分子量的測定。電泳技術與其他分離技術(如層析法)結合，可用于蛋白質結構的分析，“指紋法”就是電泳法與層析法的結合產(chǎn)物。用免疫原理測試電泳結果。提高了對蛋白質的鑒別能力。電泳與酶學技術結合發(fā)現(xiàn)了同功酶，對于酶的催化和調節(jié)功能有了更深入的了解，所以電泳技術是醫(yī)學科學中的重要研究技術。下面介紹幾個在生化實驗工作中常用的電泳技術。(一)紙電泳：是以濾紙為支持物來進行電泳，它常與其它層析方法配合使用，以提高分析效果，紙電泳一般用于物質分離分析、測定等電點、鑒別顆粒電荷的符號和判斷樣品的純度等方面。由于紙電泳具有設備簡單，化費少以及操作方便等優(yōu)點，所以目前仍為實驗室常用電泳技術之一。然而，紙電泳所用濾紙有較大的吸附力和電滲作用，使樣品顆粒泳動易受影響，所以不適用于進行測定遷移率。(二)醋酸纖維素膜電泳。醋酸纖維素是Kohn(1975)首先用于區(qū)帶電泳，它是由高純度的醋酸纖維素制成的一種細密而又薄的微孔膜。醋酸纖維素膜電泳的原理基本上和紙電泳原理相同，但由于作為支持物的醋酸纖維素膜對樣品的吸附性較濾紙小得多，因此，少量的樣品，甚至大分子物質都能得以較高的分辨率。又由于醋酸纖維素親水性較小，故而電滲作用較紙小，并且它所容納的緩沖液也較少，因此電泳的大部分由樣品傳導，可以加速樣品分離，大大節(jié)約電泳時間。雖然醋酸纖維素膜電泳的分辨能力比聚丙烯酰胺凝膠電泳和淀粉膠電泳等要低，但它具有簡單、快速、定量容易等優(yōu)點，尤其較紙電泳分辨力強、區(qū)帶清晰、靈敏度高和便于保存、照相等，所以醋酸纖維素膜電泳已取代紙電泳而被廣泛應用于科學實驗、生化產(chǎn)品分析和臨床化驗，如血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白’、同工酶等的分離分析，也用于免疫電泳層析技術上。(三)瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳是一種以瓊脂糖凝膠為支持物的凝膠電泳，其分析原理與其它支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結構，直接參與帶電顆粒的分離過程，在電泳中，物質分子通過空隙時會受到阻力，大分子物質在泳動時受到的阻力比小分子大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅依賴于凈電荷的性質和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大地提高了分辨能力。瓊脂糖凝膠通常制成板狀，凝膠濃度以0．8—1％為宜，因為此濃度制成的凝膠富有彈性，堅固而不脆，但是在制備過程中應避免長時間加熱。電泳緩沖液的pH多在6-9之間，離子強度最適為0．02-0．05。離子強度過高時，將有大量電流通過凝膠，使凝膠中水份大量蒸發(fā)，甚至造成凝膠干裂，電泳中應加以避免。由于瓊脂糖電泳具有較高分辨率、重復性好，區(qū)帶易染色、洗脫和定量以及干膜可以長期保存等優(yōu)點，所以常用于大分于物質如蛋白費等的分離分析；與免疫化學反應相結合發(fā)展成為免疫電泳技術，用于分離和檢測抗原。若對目前常用的瓊脂糖進行某些修飾，如引入化學基團羥乙基，則可使瓊脂糖在6512左右便能熔化，被稱為低熔點瓊脂糖。該溫度低于DNA的熔點，而且凝膠強度又無明顯改變。以此為支持物進行電泳，稱為低熔點瓊脂糖凝膠電泳，主要用于DNA研究。如在分子生物學實驗中，用來回收或制備DNA。(四)聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegeldectrophoresis，PAGE)聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩(wěn)定性高、無電滲作用、設備簡單、樣品量小(1—100微克)、分辨率高等優(yōu)點，并可通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠，可用于蛋白質，核酸等分子大小不同的物質的分離、定性和定量分析。還可結合解離劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，以測定蛋白質亞基分子量。聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理1．丙烯酰胺的聚合聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Act)與交聯(lián)劑甲撐雙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下，經(jīng)過聚合交聯(lián)形成含有親水性酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，相鄰的西個鏈通過甲撐橋交鏈起來的三維網(wǎng)狀結構的凝膠。2．聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小決定凝膠孔徑的大小主要是凝膠的濃度，例如7．5％的凝膠孔徑平均為50A，30％的為20A左右。但交聯(lián)劑對電泳泳動率亦有影響，交聯(lián)劑重量對總單體重量的百分比愈大，則電泳泳動率愈小。不管交聯(lián)劑是以何種方式影響電泳時的泳動率，總之它是影響凝膠孔徑很重要的一個參數(shù)，為了使試驗的重復性較高，在制備凝膠時對交聯(lián)劑的濃度、交聯(lián)劑與丙烯酰胺的比例、催化劑的濃度、聚膠所需時間這些影響泳動率的因子都應盡可能保持恒定。要想將一個蛋白質或核酸之類的大分子混合物很好地分開，并在膠柱上形成明顯的帶，選擇一定孔徑的凝膠是很關鍵的。實用中，常按樣品的分子量大小來選擇適宜的凝膠孔徑。3．緩沖系統(tǒng)目前常用的分離膠緩沖系統(tǒng)有三大類：高pH(pH9左右)、低pH(pH4左右)和中性。選擇的pH應使蛋白質分子處于最大電荷狀態(tài)，使樣品中各種蛋白質分子表現(xiàn)出泳動率的差別最大。酸性蛋白質在高pH條件下，堿性蛋白質在低pH條件下常得到較好的解離，電泳分離效果較好。假若蛋白質樣品經(jīng)電泳后還希望保留生物活性，則pH值不應過大或過小<大于9或小于4)。在考慮離子種類和離子強度時，原則上只要有導電離子存在的任何溶劑就能用于電泳，但要避免因離子種類和離子強度選擇不當使樣品中各蛋白質分于之間相互作用而造成人為假象。常選用0．01—0．1mol／L低離子強度的緩沖液。離子強度低，從而電導低，低電導能產(chǎn)生高電壓梯度，電泳分離過程短，產(chǎn)生熱量較小，分離效果好。4．聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳這里主要簡單介紹不連續(xù)盤狀電泳的基本原理。不連續(xù)盤狀電泳有較高的分辨力，這里因力有三種效應：濃縮效應，在樣品膠和濃縮膠中進行(如不用樣品膠，則在濃縮膠中進行)；電荷效應和分子篩效應在分離膠中進行。(1)濃縮效應：管中置三種不同的凝膠層，即上層為樣品膠，第二層為濃縮膠，這兩層均為大孔膠、Tris—HCl緩沖液、pH值6．7，第三層為分離膠，該層為小孔膠、Tris—HCl緩沖液、pH值8．9。在上下兩電泳槽中充以Tris—甘氨酸緩沖液，pH值8．3。這樣造成凝膠孔徑、pH值、緩沖液的不連續(xù)性。在此條件下，HCl幾乎全部電離為C1-，甘氨酸有極少部分的分子解離成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白質也能解離帶負電荷。當電泳系統(tǒng)通電后．這三種離子都向正極移動，根據(jù)有效泳動率的大小，最快的稱為快離于或先行離子(這里是Cl-)，最慢的稱為慢離子或隨后離子(這里是NH2CH2COO-)。電泳開始后，快離子在前，在它的后邊形成一離子濃度低的區(qū)域即低電導區(qū)。電導與電壓梯度成反比，所以低電導區(qū)就有了較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質和慢離子在快離子后面加速移動。在快離孑和慢離子的移動速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立后，則在快離于和慢離子之間造成一個不斷向陽極移動的界面。由于蛋白質的有效泳動率恰好介于快、慢離子之間，因此蛋白質樣品被夾在當中濃縮成一狹窄層。這種濃縮效應可使蛋白質濃縮數(shù)百倍。(2)電荷效應：蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質區(qū)，但由于每種蛋白質分于所載有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排列成一個一個的圓盤區(qū)帶。在進入分離膠時，電荷效應仍起作用。(3)分子篩效應：當被濃縮的蛋白質樣品從濃縮膠進入分離膠時，pH值和凝膠孔徑突然改變，選擇分離膠的pH值8．9(電泳時實際測量是9．5)使接近甘氨酸的pKa值(9．7—9．8)，這樣慢離子的解離度增大，因而它的有效泳動率也增加。此時慢離子的有效泳動率超過所有蛋白質的有效泳動率。這樣，高電壓梯度不存在了，各種蛋白質僅僅由于其分子量或構象的不同，在一個均一的電壓梯度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠時所受摩擦力不同、受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率不同而被分開。5．SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉(SDS)是陰離子型去污劑，當它的濃度在8X10—41'1'10VL以上時，1克蛋白質幾乎能夠恒定地與1．4克SDS結合。如前所述，蛋白質的遷移率同時與其電荷及大小有關，但由于蛋白質分子這時帶有足夠的負電荷，如果在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，將由于分子篩效應，它們的遷移率僅取決于分子的大小，因此蛋白質與SDS的結合，必須在蛋白質充分變性的狀態(tài)下才能達到飽和，因此，這一過程是在巰基試劑(2—琉基乙醇或二硫蘇糖醇)存在時加熱情況下進行的。例如，天然牛血清白蛋白或胰核糖核酸酶每克只能結合0．9克SDS，將其中的二硫鍵還原后，便增加到1．4克。糖蛋白中因為糖部分不能與SDS6．聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳蛋白質分子有一定的等電點，當它處在一個由陽極到陰極pH梯度逐漸增加的介質中，并通過以直流電時，它便“聚焦”在與其等電點相同的pH位置上。等電點不同的蛋白質泳動后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。這種電泳方法便稱為等電聚焦電泳。這種方法具有很高的分辨率，可以區(qū)分等電點只有0．01pH單位差異的蛋白質，根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質的分子量。同時，對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。所以，等電聚焦電泳也是一種得到廣泛應用的方法。這種方法的發(fā)展取決于pH梯度形成技術的開發(fā)。在電場中能夠形成pH梯度的物質必須具有以下特性：(1)有足夠的緩沖能力，樣品存在時也能保持穩(wěn)定的pH梯度；(2)有足夠的電導能力，以使一定的電流能夠通過，同時各處都應有相近的電導系數(shù)，避免局部地區(qū)過熱，以及局部地區(qū)過大電位差的差異對pH梯度的影響；(3)是小分子的物質，電泳后易于除去；(4)化學組成與被分離的蛋白質物質不同，不干擾測定；(5)不會使蛋白質變性或與其發(fā)生副反應。60年代初期，Svesson通過系統(tǒng)研究，確定多電荷的兩性電解質滿足以上的條件，Vesterberg則進一步選擇脂肪族多氨基多羥酸物物質作為介質，在電場中獲得了理想的平滑pH梯度。這種物質的商品名稱是Ampholine，它實際上是一系列不同等電點的脂肪族多氨基多羧基同系物及異構物的混合物。它是由不飽和酸(例如丙烯酸)與多乙烯多胺加成后產(chǎn)生的，反應式概括如下：④式中Rl及R2是氫或者是帶有氨基的脂肪基。由于合成物的不同分子氨基和羧基的比例不同，從而形成連續(xù)的等電點。通常的范圍有pH3—10之間。等電聚焦電泳可以在液體介質中進行，適宜作大量制備用，每個區(qū)帶能夠聚焦20—80毫克左右的蛋白質。以聚丙烯酰胺凝膠為介質時，設備簡單，操作易行，適宜于小量分離及分析。(五)雙向電泳——提高電泳分辨率的方法1975年，O’Farrell發(fā)展了雙向電泳技術，其第一向采用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，第二向采用SDS—凝膠電泳。由于結合了蛋白質的等電點和分子量兩種完全不同的特性來進行分離，因此具有非常高的分辨率。從大腸桿菌溶物中可分析出近1,100種蛋白質或肽鏈組分，甚至可以判斷出一個基團的變異。雙向電泳是鑒別蛋白質一項很有力的手段。膠板可以用考馬斯亮藍染色，檢出的最低限量為0．3—1微克／斑點。也可以用銀染法，檢出最低量為2—5納克／斑點。銀離子能與蛋白質的巰基及羧基等基團作用，經(jīng)還原后顯出黑色斑點。為了進一步提高靈敏度，還可應用放射性氨基酸(如35S—甲硫氨酸)作體內摻入，使所有的蛋白質斑點都帶有放射性標記，在x—射線底片上曝光后，獲得電泳圖譜。實驗四血漿清蛋白的分離純化與鑒定（isolation,Purificationandidentificationofplasmaalbumin）【目的和要求】掌握蛋白質的分離技術掌握分段鹽析、凝膠層析及蛋白質醋酸纖維薄膜電泳的原理及操作方法掌握電泳方法檢測分離效果【實驗內容】鹽析分段沉淀蛋白質層析脫鹽點樣、電泳、染色、漂洗觀察電泳圖譜【試劑和器材】試劑

1．飽和硫酸溶液：稱固體硫酸銨85g于100ml蒸餾水中，在70～80℃水浴中攪拌溶解，用濃氨水調PH為7.2，室溫放置過夜，瓶底析出白色結晶，上層液即為飽和硫酸銨液。

2．生理鹽水：稱取分析純NaCl0.89克，蒸餾水稀釋至1000ml.

3．葡聚糖凝膠SephadexG-25:稱取10克SephadexG-25，加入200ml0.02mol/lPH6.5磷酸鹽緩沖液溶脹4．10％三氯醋酸。

5．1％氯化鋇溶液6．pH8.6，離子強度0.06巴比妥電極緩沖液：稱取巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g，蒸餾水加熱溶解后再加水至1000ml。

7．氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水40ml溶解。

8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸餾水50ml。器材

1．電泳儀、電泳槽

2．電動離心機、層析柱

3．鑷子、培養(yǎng)皿、X光軟片、濾紙4．離心管、燒杯、量筒、滴管、小試管、吸管【實驗原理】不同的蛋白質的分子量、溶解度、以及在一定條件下帶電的情況有所不同，可以更據(jù)這些性質的差別，分離及提純各種蛋白質。利用硫酸銨分段鹽析法將血清中的清蛋白及球蛋白分離，清蛋白液再利用葡聚糖凝膠過濾法除鹽，即可得到較純的清蛋白。純化后的清蛋白可利用醋酸纖維薄膜電泳法鑒定其純度。鹽析：是指將中性鹽（如硫酸銨）加入蛋白質溶液中，中和Pr蛋白質表面電荷及破壞水化膜，使蛋白質相互聚集在析出。分段鹽析：各種蛋白質鹽析時所需的鹽濃度和PH不同，利用不同鹽濃度下Pr溶解度不同，將蛋白質分段沉淀下來。半飽和硫酸銨沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）將血清清蛋白和球蛋白初步分離。常用的除鹽方法：半透膜透析；凝膠過濾（層析）。在葡聚糖凝膠層析柱中，由于蛋白質和鹽的分子量不同，洗脫速度也不同，大分子蛋白質不能進入凝膠的網(wǎng)孔內而先流出，小分子鹽則可進入網(wǎng)孔滯留在凝膠內，收集蛋白洗脫液，即可得到脫鹽的蛋白質。用三氯醋酸液鑒定洗脫的蛋白液，以BaCL2檢測硫酸銨。純化后的清蛋白用醋酸纖維薄膜電泳鑒定蛋白質分離效果【操作】鹽析沉淀血清球蛋白取離心管1支，加入鹽析用蛋白質溶液3ml（血漿1ml和生理鹽水2ml），再逐滴加入pH7.2飽和硫酸銨液3.0ml，充分搖勻。靜置20分鐘后離心（3000rpm×10分），取上清液（此液中主要含清蛋白）備用。

2．凝膠層析脫鹽

⑴裝柱：取層析柱（1×20cm）,關緊下端出口，