實(shí)驗(yàn)九環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)擴(kuò)增單純皰疹病毒II型DNA（Loop-mediatedisothermalamplication）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.掌握LAMP擴(kuò)增單純皰疹病毒II型DNA的基本原理。2.熟悉LAMP擴(kuò)增單純皰疹病毒II型DNA的操作過(guò)程。實(shí)驗(yàn)原理環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(Loop–mediatedisothermalamplification，LAMP)，它針對(duì)靶基因的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四條特異性引物,利用鏈置換DNA聚合酶(BstDNAPolymerase)在等溫條件下高效、快速、特異地?cái)U(kuò)增靶序列。其中四條引物包括兩條外引物(F3、B3)和兩條內(nèi)引物（FIP、BIP），F(xiàn)IP又由F1c-F2組成，BIP由B1c-B2組成，F(xiàn)1c、B1c分別是F1和B1的互補(bǔ)序列。擴(kuò)增過(guò)程分為兩個(gè)階段：第一階段：起始階段。任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補(bǔ)單鏈。FIP上的F1c與此單鏈上的Fl為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動(dòng)類(lèi)似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開(kāi)始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3’末端的B1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板。進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換．形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。且產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度增加一倍。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物。且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。LAMP技術(shù)特點(diǎn)1.靈敏度高：普通PCR的十倍2.特異性強(qiáng)3.速度快。滿(mǎn)足臨床樣本快速檢測(cè)需要4.設(shè)備簡(jiǎn)單5.操作簡(jiǎn)便6.檢測(cè)便捷：LAMP在合成DNA的同時(shí)還產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀,可根據(jù)反應(yīng)體系中是否形成白色沉淀來(lái)定性判斷LAMP結(jié)果LAMP技術(shù)應(yīng)用1.病毒檢測(cè)2.細(xì)菌檢測(cè)3.真菌與寄生蟲(chóng)的檢測(cè)4.動(dòng)物胚胎性別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用具藥品單純皰疹病毒（herpessimplexvirus,HSV）是最早發(fā)現(xiàn)的人類(lèi)皰疹病毒，也是所有人類(lèi)病毒性疾病中最常見(jiàn)的病毒。它有兩種血清型HSV-I和HSV-II，本實(shí)驗(yàn)選擇特異性基因HSV-II-gD基因作為L(zhǎng)AMP引物設(shè)計(jì)的靶序列，最后選出一套擴(kuò)增區(qū)域位于GeneBank中的141080-141282之間的引物，引物序列如下：擴(kuò)增目的序列如下：gtcgcggtgggactccgcgtcgtctgcgccaaatacgccttagcagacccctcgcttaagatggccgatcccaatcgatttcgcgggaagaaccttccggttttggaccagctgaccgacccccccggggtgaagcgtgtttaccacattcagccgagcctggaggacccgttccagccccccagcatcccgatcactgtgtactacgcagtgctggaacgtgcctgccgcagcgtgctc1.實(shí)驗(yàn)器材PCR擴(kuò)增儀，離心機(jī)，電泳儀，移液槍等2.實(shí)驗(yàn)試劑試劑濃度Betaine5MBstDNA聚合酶8U/μldNTPs2.5mMofeachF3、B3、FIP、BIP25μM瓊脂糖凝膠2﹪10×Thermopol緩沖液（與BstDNA聚合酶配套購(gòu)買(mǎi)）實(shí)驗(yàn)步驟1.提取含有目的片段的質(zhì)粒作為陽(yáng)性模板（為了便于提取目的DNA，我們將靶序列克隆到質(zhì)粒中）。2.紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒的濃度，調(diào)節(jié)質(zhì)粒濃度在每微升10到100微克之間。3.模板0.5ulH2O10.5B30.4F30.4BIP1.6FIP1.6dNTPs4Betaine2.510×Thermopol2.5BstDNA聚合酶195度5分鐘，冰上3分鐘4.5000r/m離心5min,放入65℃的擴(kuò)增儀中恒溫1個(gè)小時(shí)。5.