第五章花藥和花粉培養(yǎng)第1頁，共77頁。第五章花藥和花粉培養(yǎng)

本章主要內容：花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應用花粉小孢子發(fā)育途徑花粉和花藥培養(yǎng)方法單倍體植株鑒定和染色體加倍

第5章花藥和花粉培養(yǎng)第2頁，共77頁。第一節(jié)花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應用花粉和花藥培養(yǎng)的概念花藥和花粉培養(yǎng)的歷史花粉和花藥培養(yǎng)的應用第3頁，共77頁?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng)(pollenandantherculture)

是指在人工合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑,使其不形成配子，而像體細胞一樣進行分裂\分化，由單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術。第5章花藥和花粉培養(yǎng)單倍體植物(haplobiont)用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株。花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)；胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）一、概念第4頁，共77頁。第5章花藥和花粉培養(yǎng)第5頁，共77頁。異同點：相同點：二者培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導花粉細胞發(fā)育成單倍體細胞，最后發(fā)育成單倍體植株。不同點：花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花藥是植物花的雄性器官，包括體細胞性質的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細胞的花粉?；ǚ叟囵B(yǎng)屬細胞培養(yǎng):花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數小孢子產胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產量高。但技術更復雜，比花藥培養(yǎng)難度大。第6頁，共77頁。二、植物花藥/花粉培養(yǎng)歷史Guha和Maheshwari（1964）曼陀羅花藥培養(yǎng)Nitsch和Norreel(1973)煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）80年代后期到90年代期間，花培技術迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。90年代，一些先前被認為是不易進行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功Konzak(1999)。第7頁，共77頁。通過花藥培養(yǎng)育成的甜椒新品種

：

海花三號

第8頁，共77頁。三、花藥和花粉培養(yǎng)的應用1)誘導形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；第5章花藥和花粉培養(yǎng)供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內獲得純系常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。1、作物育種第9頁，共77頁。常規(guī)育種在雜交F5、F6代開始選擇；花藥培養(yǎng)在F1或F2代進行培養(yǎng)，再人工加倍處理．縮短育種周期3--5年克服后代分離，大大縮短育種周期第二節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)的應用第10頁，共77頁?；ǚ蹎伪扼w是純合配子體，從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。2)提高目標基因型的選擇效率第11頁，共77頁。例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株

常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb Aabbab aAbB aabBaAbb aabb第12頁，共77頁。例子：

二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株

單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培

從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。第13頁，共77頁。

3)誘變育種中的作用植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當代及時獲得突變個體，染色體加倍后成為穩(wěn)定的純系。第14頁，共77頁?？商剿饔H本染色體組的構成。分析單倍體植物減數分裂時，形成二價體的數目和形狀，能確定染色體組內是否存在同源染色體。2、物種進化研究

第15頁，共77頁。

單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質及其作用。還可用于基因的劑量效應分析。3、遺傳分析

第16頁，共77頁。4、構建連鎖圖譜

雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構建。第17頁，共77頁。能直接表達外源基因，不受顯隱性影響5、用于遺傳轉化

第18頁，共77頁。第二節(jié)花粉孢子體發(fā)育途徑概念：花粉孢子體發(fā)育途徑（雄核發(fā)育途徑）

花粉是產生花粉植株的原始細胞，其第一次有絲分裂，在本質上與合子的第一次孢子體分裂相似，把花粉形成植株的途徑稱為花粉孢子體發(fā)育途徑，也叫雄核發(fā)育途徑第19頁，共77頁。一、花粉發(fā)育的階段花粉離體培養(yǎng)時，雄核發(fā)育最適宜的時期一般是第一次有分裂或之前。第20頁，共77頁。二、雄核發(fā)育途徑1、A途徑小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營養(yǎng)細胞和生殖細胞

（1）A-V途徑由營養(yǎng)細胞重復分裂形成單倍體（2）A-G途徑由生殖細胞重復分裂形成單倍體（3）A-VG途徑（E途徑）由營養(yǎng)細胞和生殖細胞各自獨立分裂，共同形成單倍體（4）C途徑營養(yǎng)細胞和生殖細胞通過核融合，形成多倍體植株2、B途徑

小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩個細胞。然后由這兩細胞邊續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株第21頁，共77頁。第22頁，共77頁。1、雄核發(fā)育與P花粉的形成

P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理

饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動雄核發(fā)育。三、雄核發(fā)育啟動機理第23頁，共77頁。

1、胚狀體發(fā)育途徑

小孢子經歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑

小孢子分裂數次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復雜。四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式第24頁，共77頁。胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第25頁，共77頁。通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)第26頁，共77頁。胚狀體發(fā)育途徑a)球形胚d)

魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)第27頁，共77頁。愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)第28頁，共77頁。愈傷組織轉接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)第29頁，共77頁。第三節(jié)花粉和花藥培養(yǎng)方法一、花藥培養(yǎng)二、花粉培養(yǎng)三、白化苗現(xiàn)象四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素第30頁，共77頁。一、花藥培養(yǎng)1、取材

鏡檢，根據花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。

3、培養(yǎng)

固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。第31頁，共77頁。二、花粉培養(yǎng)(一)花粉的分離與純化

1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法

在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。第32頁，共77頁。1）磁攪拌法

用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；2）超速旋切法

通過攪拌器中的高速旋轉刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子3、機械游離第33頁，共77頁。梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）第34頁，共77頁。(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)

花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)

花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)

花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

第35頁，共77頁。4、看護培養(yǎng)

利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質促進花粉小孢子發(fā)育。用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖。這個愈傷組織塊稱為看護愈傷組織第36頁，共77頁。1）在一個培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。2）在無菌條件下，將一小塊（1cm3）活躍生長的愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片（1cm2）已滅菌的濾紙，放置過夜。3）將分離的花粉接種到已經充分吸收愈傷組織滲透液的濾紙上。4）單細胞分裂形成肉眼可見的小細胞團后，即轉移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)，得到單細胞無性系。具體方法2.第37頁，共77頁?？醋o培養(yǎng)圖解第38頁，共77頁。5、微室培養(yǎng)

利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)。6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)

利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。第39頁，共77頁。微室培養(yǎng)圖示：1滴含單細胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油旁邊各加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖凹穴載玻片置培養(yǎng)皿中26~28℃恒溫培養(yǎng)第40頁，共77頁。花粉培養(yǎng)過程取花蕾（鏡檢）預培養(yǎng)數天取花藥消毒分離花粉第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術接種培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生第41頁，共77頁。三、白化苗現(xiàn)象第42頁，共77頁。（一）白化苗產生的影響因素及機理1、內因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時期。2、外因 預處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉分化時間等。3、機理 核基因起關鍵作用，導致質體DNA缺失，產生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。第43頁，共77頁。（二）白化苗的控制

通過對花粉發(fā)育時期、預處理、培養(yǎng)基成分等因素進行調控。

第44頁，共77頁。四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素（一）基因型

植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對小孢子離體誘導反應差異較大。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠低于糯稻。第45頁，共77頁。小孢子發(fā)育時期對誘導雄核發(fā)育非常重要。（三）花粉發(fā)育時期適宜時期：單核期,尤其是單核中、晚期(單核靠邊期)第46頁，共77頁。蕓苔屬植物Brassicanapus不同基因型的小孢子產胚率比較Topas

10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,0000.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty10-1000.001-0.01基因型 胚狀體數量/106小孢子成苗率（%）第47頁，共77頁。1、植株生長條件光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2、植株生長時期一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3、P花粉的頻率不同溫度、日照時數、氮饑餓及生長物質處理提高P花粉的數量（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài)

第48頁，共77頁。隨著細胞體積迅速增大，細胞核由中央位置推向一邊，即單核靠邊期。。雄配子體的發(fā)育營養(yǎng)細胞生殖細胞精子第49頁，共77頁。四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子第50頁，共77頁。單核晚期液泡第一次有絲分裂后期雙核早期雙核中期生殖核生殖核營養(yǎng)核第51頁，共77頁。一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對誘導反應最敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細胞分裂產生胚狀體。

第52頁，共77頁。不同物種誘導胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時期發(fā)育時期物種減數分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期煙草單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍四分孢子期至雙核期玉米第53頁，共77頁。對不同發(fā)育階段的花藥進行培養(yǎng)測試確定最佳小孢子發(fā)育時期的形態(tài)特征注意形態(tài)特征會因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽花粉發(fā)育時期的確定第54頁，共77頁。單核期的確定：

根據細胞觀察推測，雙核期的花粉中開始積累淀粉，不能使花粉發(fā)育成植株。通常采用醋酸洋紅或碘化鉀染色，再壓片鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時期。

但是接種前不可能把所有的花粉都進行一次發(fā)育時期的鏡檢，通常是按照花蕾長度大小與花粉發(fā)育年齡的相關性，實際操作中取一定大小的花蕾進行的。第55頁，共77頁。A.通過顯微鏡下觀察確定小孢子發(fā)育時期

醋酸洋紅染色DAPI

染色第56頁，共77頁。B.通過花蕾外部特征確定小孢子發(fā)育時期

花蕾的外部形態(tài)特征與小孢子的發(fā)育時期有一定的相關性，花蕾萼裂基部與花冠頂部之差可以作為判斷小孢子發(fā)育時期的基本指標。

第57頁，共77頁。預處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件

預處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當的預處理能使綠苗產量大量增加。預處理方法：主要是對花藥進行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學物質、離心、射線等。

（四）預處理第58頁，共77頁。1、高低溫處理

低溫冷藏是最常用的方法

從健壯無病植株采集花蕾，將花蕾用濕紗布包裹放入塑料袋中，置冰箱冷藏。低溫處理可阻止小孢子正常分化，使停留于單核狀態(tài)的花粉顯著增多，有利于誘導分化愈傷組織和胚狀體。

例子:十字花科未經低溫預處理的花蕾，每花藥產胚數為4.39個，6-9℃處理1天，產胚數提高到61.4個，預處理4天后，胚狀體產量降為10.47個。

預處理方法：第59頁，共77頁。高溫處理（熱擊處理）：

指花藥接種后，先在較高溫度下（30-35℃）培養(yǎng)數天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。

例子:如煙草，32℃高溫；小麥，33℃高溫預處理顯著地提高了小孢子胚胎發(fā)生能力（Touraev，1996）第60頁，共77頁。2、化學物質處理包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化。3、其它包括γ射線、離心、磁場等。

第61頁，共77頁。（五）培養(yǎng)基

1.基本培養(yǎng)基

主要為N6和MS培養(yǎng)基。MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。Nitsch培養(yǎng)基:適合蕓薹屬和曼陀羅屬。高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽對花粉胚狀體發(fā)育很重要?；钚蕴看龠M胚狀體發(fā)育。

第62頁，共77頁。包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。在辣椒花藥培養(yǎng)中以6%的蔗糖濃度對胚狀體的誘導率為最高。在番茄花藥培養(yǎng)中需要量高達14％。其原因是花粉母細胞的滲透壓比花絲等體細胞高的緣故，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細胞的生長，而利于花粉的生長。一般認為單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。較高濃度蔗糖可誘導花粉形成愈傷組織；

較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。2.碳源第63頁，共77頁。3、激素

細胞分裂素可促進胚狀體形成；

生長素可誘導愈傷組織形成。

細胞分裂素與生長素比值高時可誘導愈傷組織分化苗4、氨基酸5、活性碳6、pH

第64頁，共77頁。（六）培養(yǎng)條件

1、溫度

物種間有差異，培養(yǎng)溫度在25～28℃左右2、光照

光暗交替培養(yǎng)，每天12～18h的光照，光照強度2000～10000lx。3、植板密度植板密度與花培效率有很大的相關性。5×103到2×104／ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數量的、但相對低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。第65頁，共77頁?；ㄋ幗M織的存在對小孢子的胚性分裂具有明顯的促進作用。但花藥壁損傷會釋放有毒物質影響小雄核的發(fā)育。（七）花藥壁因素第66頁，共77頁。第四節(jié)單倍體植株鑒定和染色體加倍一、倍性鑒定二、染色體加倍第67頁，共77頁。一、倍性鑒定（為什么要進行倍性鑒定？）1、染色體直接計數法通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進行制片，直接計數染色體數目。2、間接鑒定（1）掃描細胞光度儀鑒定（流式細胞儀）主要測定葉片單個細胞中DNA的含量確定細胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細胞形態(tài)學鑒定法 葉片保衛(wèi)細胞大小、單位面積上的氣孔數及保衛(wèi)細胞中葉綠體的大小和數目與倍性具有高度的相關性。（3）植株形態(tài)學鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結實。第68頁，共77頁。（4）雜交鑒定法

自交或測交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細胞。（5）分子標記鑒定 包括生化標記（如同工酶標記）和分子標記（如RFLP、RAPD、AFLP等）第69頁，共77頁。二、染色體加倍（為什么要進行加倍？）1.自然加倍:

花粉細胞核有絲分裂或核融合可自然加倍，其優(yōu)點是不會出現(xiàn)畸形，缺點是隨機性強，難以掌握和利用。2.人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結實的二倍體植株。3.愈傷組織反復繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株。

將單倍體植株（孢子體）的莖段、葉柄、根莖切下，置適宜的培養(yǎng)基上使之發(fā)生愈傷組織，反復繼代后再將愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基上，即可獲得較多二倍體植株。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會有一定高頻率的核內有絲分裂，從而形成二倍體細胞，分化出純合的二倍體植株。第70頁，共77頁。第一節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)技術單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生殖孤雄生殖無配子生殖也稱單性生殖，即卵不經過受精也能發(fā)育成正常的新個體

配子體可以不經過配子的結合，而直接產生孢子體的，這種現(xiàn)象叫做無配子生殖第71頁，共77頁。花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)”形成小植株。選擇