研究生實驗技能培訓(xùn)講座

－－細胞培養(yǎng)基本知識

實驗教學(xué)中心侯孟君基本概念細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞系細胞株原代培養(yǎng)傳代細胞培養(yǎng)(cellculture)技術(shù)

即是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。細胞系

培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞有限細胞系（FiniteCellLine）連續(xù)細胞系或無限細胞系（InfiniteCellLine）腫瘤細胞系或株

我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞具有不死性和異體接種致瘤性。

細胞株用單細胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長特性的細胞群再由原細胞株進一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株。細胞系或細胞株的命名以供體患者的姓名命名：

HeLa（來源于宮頸癌）

以時間地點來命名：

CHO中國倉鼠卵巢細胞（ChineseHamsterOvary，）宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3：美國國立衛(wèi)生研究院（NationalInstituteofHealth）建立每3天傳代，每次接種3×105細胞／ml以組織來源命名：如BHK(幼地鼠腎細胞)

以臨床疾病類型命名：如BALL-1細胞系(來自B淋巴細胞急性白血病人白細胞)

原代培養(yǎng)

直接從體內(nèi)取出的細胞進行的第一次培養(yǎng)物。優(yōu)點：組織細胞剛脫離機體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。

大鼠肝細胞原代培養(yǎng)

1.細胞種類：大鼠原代肝細胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)；

細胞狀態(tài)與特征簡述：剛分離時球形透亮，貼壁后呈不規(guī)則。傳代將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)的細胞在生長、繁殖一定時間后，由于空間不足或細胞密度過大導(dǎo)致營養(yǎng)枯竭，會影響細胞的生長，因此需要進行擴大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。

HepG2細胞

細胞種類：人肝腫瘤細胞；

培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天；

細胞狀態(tài)與特征簡述：呈多角型、不規(guī)則貼壁生長，成團聚集。

傳代注意事項接種數(shù)量為5×104～8×105個/ml傳代密度太低，細胞容易死亡，表現(xiàn)出細胞在達到增長前有較長的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細胞已經(jīng)達到最大密度需要換液或進行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細胞，等長滿培養(yǎng)瓶表面，即可進行傳代。細胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件細胞生長條件細胞檢測條件細胞保存條件實驗室安全細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。（使用前）紫外照射（1小時）每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒生物安全柜

使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射10－30分鐘，預(yù)工作10－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)。使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈。還要定期用福爾馬林熏蒸。常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

玻璃器皿的清洗一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟新的橡膠制品洗滌方法0.5MNaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸15分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50℃烤干備用。

消毒前包裝常用的包裝材料牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔火焰消毒在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。培養(yǎng)瓶滴管、試管、吸管細胞培養(yǎng)的實驗用品

細胞培養(yǎng)瓶

25平方厘米，正方斜頸25平方厘米，三角斜頸75平方厘米，正方斜頸75平方厘米，三角斜頸150平方厘米，正方斜頸

細胞培養(yǎng)板

6孔，12孔，24孔，48孔96孔

細胞培養(yǎng)皿

35mm

60mm

100mm

凍存管

1.2ml2ml，5ml離心管

15ml

50ml細胞刮濾器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌。液氮罐何處購買細胞ATCC細胞庫().美國菌種保藏中心又稱美國模式菌種收集中心(ATCC)是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供以下物品

細胞系3000種細菌和噬菌體15000種動植物病毒2500種原生動物1200種以及重組物品歐洲動物細胞庫(ECACC)和日本細胞庫(RCB)

國內(nèi)細胞庫中國科學(xué)院細胞庫中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心

聯(lián)系方法：

地址：上海市岳陽路320號，200031

電話54920405

Fax/p>

聯(lián)系人：陳松華，徐惠均

e-mail:shchen@

/cctcc/fzlbc/pywml.htm中國典型培養(yǎng)物保藏中心也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物/生物材料／菌種保藏機構(gòu)

訂購程序向中心訂購培養(yǎng)物，可查閱CCTCC培養(yǎng)物目錄，并向CCTCC提出訂購培養(yǎng)物的名稱、CCTCC保藏號等內(nèi)容。聯(lián)系方式可通過電話、傳真，信函，電子郵件等方式。電話真-mail:cctcc@細胞系：300～500元/每株菌種準備時間

一般情況CCTCC收到訂購人的匯款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。

細胞的營養(yǎng)碳水化合物、氨基酸和脂類三大類也需要一定量的無機鹽、維生素和微量元素細胞培養(yǎng)液

水平衡鹽溶液pH調(diào)節(jié)液消化液抗生素溶液培養(yǎng)基水：新鮮配置的三蒸水或去離子水桶裝水：怡寶細胞培養(yǎng)用液的配制平衡鹽溶液主要由無機鹽和葡萄糖配制而成作用維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度常用的緩沖液生理鹽水PBSHanks液

（D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液）pH調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液(2)Hepes緩沖液是一種可以保持細胞培養(yǎng)過程中pH值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑通常使用濃度為10～15mM消化液胰蛋白酶溶液主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細胞從瓶壁上脫落并使細胞游離分散開來常用濃度為0.25%或5%胰蛋白酶。(2)EDTA溶液作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，可用EDTA和胰酶的混合液

EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應(yīng)加堿助溶(3)膠原酶溶液膠原酶在上皮類細胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產(chǎn)生損傷?？股厝芤和ǔＪ乔嗝顾睾玩溍顾芈?lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細菌污染。

培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位

培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：血清血漿組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）

合成培養(yǎng)基

根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、另有無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基RPMI1640最初是由G，E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細胞而設(shè)計的。開始的配方特別適合于懸浮細胞生長，主要是針對淋巴細胞，后經(jīng)過改良，從RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其組分較為簡單，適合許多種細胞生長，如腫瘤細胞、正常細胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。尤其適合人白細胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、K-562及KATO—III等細胞系的培養(yǎng)。

RPMI1640種類RPMI—1640（A）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）RPMI—1640（A）無酚紅（不含谷氨酰胺、高壓滅菌）RPMI—1640（含谷氨酰胺、除菌過濾滅菌）

DMEM細胞培養(yǎng)基

是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的與MEM比較增加了各種成分用量，同時又分為高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難腫瘤細胞等。

DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】

DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過濾滅菌】

DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過濾滅菌】。

干粉培養(yǎng)基的配制

認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實驗需要決定。配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。所用器皿應(yīng)嚴格消毒。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾，無菌保存于4度。血清的使用血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵常用血清胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。優(yōu)質(zhì)血清的標準透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）56℃，30分鐘。血清的消毒過濾除菌。牛血清胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛新牛血清取自出生24小時之內(nèi)的新生牛小牛血清取自出生10－30天的小牛使用濃度：一般為5－20％，最常用是10％

何謂FBS、FCS、CS、HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清HS(horseserum)則是指馬血清

血清解凍步驟逐步解凍法–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。勿直接由–20℃至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。

無機鹽CaCl2、KCl、MgSO4、NaCl、NaHCO3、NaH2PO4對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。氨基酸

纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)細胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成谷氨酰胺具有特殊的作用，補加一定量的谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。休息一會兒吧！伸伸腿，彎彎腰！體外培養(yǎng)細胞的分型

貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，大致分成以下四型：成纖維細胞上皮型細胞游走細胞型多型細胞型1、成纖維細胞型

名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核生長特點：排列成放射狀，漩渦狀細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動，游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起成纖維細胞

HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細胞

1.細胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+15％胎牛血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈梭形，扁平形或多角形，貼壁生長。

骨髓間充質(zhì)干細胞

1.細胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細胞原代；

2.培養(yǎng)天數(shù)：7天；

3.放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；

4.培養(yǎng)基種類：DF12+10％FBS；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：使用percoll密度梯度離心法分離人骨髓細胞。首次換液48h，這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細胞擴增情況。

2、上皮型細胞名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長特點：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀

生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動上皮型細胞SKOv3（卵巢癌細胞）

1.細胞種類：SKOv3（卵巢癌細胞）2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞貼壁生長，生長速度較快。

CCL-149

1.細胞種類：大鼠肺泡上皮細胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈梭形，透亮貼壁生長，3－4天傳代一次，Giemsa染色。

3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。

CNE1

1.細胞種類：高分化鼻咽癌細胞系；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：3d；

3.放大倍速：相差100；

4.培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細胞，梭型成團生長。4、多型細胞型有一些細胞，如神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

SD大鼠神經(jīng)元原代

1.細胞種類：腦皮質(zhì)細胞；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：4-5天；

3.放大倍速：電鏡20000；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清+10%馬血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：貼壁細胞，有多量軸突和樹突。

懸浮型概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，

易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)HL-60分化細胞Giemsa染色1.細胞種類：HL-60；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA1微摩爾作用5天；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：1640+8％胎牛血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：懸浮細胞，分化的細胞核漿比例減小，核仁減少或消失，胞核呈桿狀或分葉狀。

KU812

1.細胞種類：人嗜堿細胞性白血病細胞系；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：5d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X20；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈圓形，懸浮生長。

HeLa細胞

1.細胞種類：人HeLa細胞傳代培養(yǎng)；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：7d；

3.放大倍速：倒置顯微鏡X200；

4.培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；

5.細胞狀態(tài)與特征簡述：細胞呈多角形，貼壁生長。

K562細胞

1.細胞種類：K562（人慢性紅白血病細胞株）；

2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；

3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡X10；

4.培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，4mMGlutamine；

5.細胞狀態(tài)與特征簡介：懸浮生長，少數(shù)貼壁，喜愛成團懸浮。

每代貼壁細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）游離期

懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細胞變?yōu)閳A球形。吸附期

貼附底物，一般24小時內(nèi)貼壁。潛伏期

此時細胞有生長活動，基本無增殖。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期

細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停止期（平臺期）

細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性根據(jù)細胞生長的恃點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。2．半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3．貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細胞傳代方法首次傳代注意事項細胞生長密度不高時，不能急于傳代原代培養(yǎng)的貼壁細胞需控制消化時間吹打已消化的細胞應(yīng)減少機械損傷首次傳代時細胞接種數(shù)量要多一些首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些小牛血清濃度可加大至15%～20%左右

細胞計數(shù)計數(shù)結(jié)果以每毫升細胞數(shù)表示細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同血細胞計數(shù)器：手工計數(shù)細胞Coulter計數(shù)儀：人工計數(shù)細胞計數(shù)步驟1、將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。3、靜置3分鐘。4、鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)。細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×104

注意：壓線細胞只計左側(cè)和上方的。鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應(yīng)按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。培養(yǎng)細胞活力測定細胞活力：總細胞中活細胞所占的百分比由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。測定方法臺盼藍法活細胞不被染色，死細胞染成藍色。流式細胞儀

細胞活性指標通常包括細胞膜對核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。

3．四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；MTT比色法的原理：

活細胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標儀測定OD值；細胞凍存和復(fù)蘇細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下