細胞培養(yǎng)一、無菌實驗室二、常用的儀器設(shè)備三、細胞培養(yǎng)需要的物品四、細胞培養(yǎng)用液和培養(yǎng)基五、細胞培養(yǎng)基本技術(shù)一、無菌實驗室組成：更衣間：放在外，供更換衣帽、鞋子等之用。緩沖間：位于更衣間與操作間之間，也可同時與幾個操作間相通。操作間：放在內(nèi)間，供無菌操作和細胞培養(yǎng)，房間不受日光直射，大小適宜，高2.5m。二、實驗室常用設(shè)備使用壓力蒸汽消毒器1.使用前的準備：檢查進氣閥及排氣閥是否關(guān)閉，并加入適量水。

2.裝放滅菌物：然后加蓋旋緊螺旋，密封。3.預熱及排氣：4.升壓保溫：一般為103.43kPa，溫度則相當于121.3℃時，持續(xù)15～20min即可達到滅菌目的。5.降壓開蓋取物：關(guān)電源，待其壓力下降至零時，方可開蓋取物?！臼褂梅椒ā扛稍锵溆糜诩毎囵B(yǎng)的有些器械、器皿要烘干才能使用，玻璃器皿需干熱消毒，因此，細胞培養(yǎng)實驗室均配置有電熱干燥箱。干熱消毒時，升溫較高，一般需達到160℃。水純化裝置進行細胞培養(yǎng)時，配制各種培養(yǎng)液及試劑等均需使用三次蒸餾水；即使用于玻璃器皿的沖洗，至少也應是二次蒸餾水。蒸餾水器、壓力蒸氣消毒器和電熱干燥箱都是屬于大功率電器，使用時一定要注意用電安全，盡量做到分開時間使用。超凈工作臺CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱：控溫及的提供所需的CO2，使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定。通常使用條件為37℃，5％CO2CO2供氣凋節(jié)方法倒置顯微鏡離心機進行細胞培養(yǎng)時，常需要制備細胞懸液、調(diào)整細胞密度、洗滌、收集細胞等，因此要使用離心機。平衡是關(guān)鍵電子分析天平冰箱細胞冷凍儲存器1、凍細胞和組織2、注意液氮含量酸度計

酶標儀特殊設(shè)備如有條件，可添置一些特殊或先進的設(shè)備儀器，使實驗室工作做得更有效、更精確、更深入。有關(guān)的特殊或先進設(shè)備如下：超低溫冰箱，–70℃以下的冰箱便于儲存有些試劑及標本；熒光顯微鏡，進行熒光染色樣本的觀察；更精確及快速檢測細胞用的流式細胞儀等。三、細胞培養(yǎng)需要的物品：1、培養(yǎng)瓶（培養(yǎng)液、消化液以及PBS）。2、藍口瓶、離心管、吸管、凍存管、燒杯、量筒、飯盒、培養(yǎng)皿、封口膜3、槍頭（TIP頭）4、培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿，細胞計數(shù)板5、手術(shù)器械。1、清洗2、浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中浸泡時間：一般為過夜，不應少于6小時清潔液常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）強清潔液63∶1000∶200次強清洗液120∶200∶1000

弱清潔液100∶100∶1000需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈3、消毒物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小時過濾：0.22μm化學消毒滅菌法75%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒抗生素（主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預防培養(yǎng)物污染）四、細胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基☆培養(yǎng)用液——水（三蒸水）平衡鹽溶液（PBS）消化液☆培養(yǎng)基——天然培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基

配液前準備：①濾器、磁力攪拌器、燒杯、量筒、注射器。貯液瓶（生理鹽水瓶）、0.15Mpa，121℃，30分鐘蒸氣滅菌②NaHCO3、胎牛（小牛）血清、青霉素、鏈霉素、三蒸水、培養(yǎng)基粉劑平衡鹽液體（Balancedsaltsolution,BSS）組織細胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細胞生存所需的能量和無機離子成分如：PBS、Hanks用途：用于洗滌組織、細胞或配制消化液時等配制：購買+高壓消化液——分散組織、細胞作用：（1）在進行原代培養(yǎng)過程中需分散組織、細胞。（2）在傳代中要使細胞脫離附著的底物時均需使用消化液。類型：組織細胞培養(yǎng)中常用的消化液為胰蛋白酶、二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）及膠原酶溶液，可以分別單獨使用或混合使用。特點：1、胰蛋白酶的活力用解離酪蛋白的能力來表示，常用的有1：125和1：250兩種。2、許多學者認為鈣、鎂離子和血清的存在都會降低胰蛋白酶的活力。消化細胞時，加入一些血清（10%）或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用。胰蛋白酶液(Trypsin)稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許或PBS溶液調(diào)成糊狀，再補足PBS，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，過濾除菌，分裝入瓶中，-20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，常用濃度?.25%（0.1%-0.5%）。如果短期內(nèi)要使用，就放置4℃冰箱。胰蛋白酶溶液配制：

抗生素溶液通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數(shù)細菌污染。

培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。一般市售市售鏈霉素為100萬U/瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)基——維持體外細胞生存和生長的溶液1、天然培養(yǎng)基2、合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：RPMI1640，DMEM等。

一般需加血清等

市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點是價格便宜。缺點是配制過程繁瑣，質(zhì)量不易控制，配制時需要補加NaHCO3，調(diào)PH。配制好后，用過濾法消毒除菌，采用0.22μm。分裝于玻璃瓶中，使用時再加血清。液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標準規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便根據(jù)包裝袋上的要求和實驗需要補加NaHCO3和谷氨酰胺。加抗生素：上述溶液配制好后，用過濾法消毒除菌，采用0.22μm。分裝于玻璃瓶中，使用時再加血清。大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH四、滅活胎牛血清（FBS）與分裝過程：1、一般外購的血清只作過滅菌，在用前常需進行滅活處理。2、熱滅活：56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清（加溫到56℃，30min），以消除補體活性，未滅活血清應保存在–20℃冰箱。牛血清分裝：在無菌的條件下一般分裝成10ml一管，貯存于-20OC.使用時放置4OC冰箱過夜色解凍。五、細胞培養(yǎng)基本技術(shù)1、細胞原代培養(yǎng)2、細胞生長狀況的觀察3、細胞傳代4、細胞凍存、復蘇和運輸5、細胞活力檢測6、細胞周期檢測7、細胞凋亡檢測8、細胞凋亡的流式分析1、細胞原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。1、取材2、漂洗3、剪切4、消化5、過濾6、清洗7、計數(shù)8、接種2、細胞生長狀況的觀察培養(yǎng)細胞生長狀況常規(guī)檢查1、培養(yǎng)液：顏色與透明度的變化2、細胞生長狀況。3、細胞形態(tài)變化。4、微生物污染。1、培養(yǎng)液PH值（顏色變化）變黃，表示PH值下降，細胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生的酸性物不斷積累導致。變紅或紫紅色，表示PH值上升，細胞生長停滯、死亡。一般生長穩(wěn)定的細胞需要2-3天換液1次，生長慢的細胞需要3-4天換液一次。原代細胞換液通常每周兩次，每次換半量或1/5-1/3量。原代細胞第1次換液時，切記不要把培養(yǎng)液全部倒掉。(2)細胞系(株)換液:條件合適時生長迅速，過夜就變黃，可進行全量換液。這種情況下，最好減少細胞接種數(shù)，延長換液的時間。方法:2、細胞形態(tài)變化：生長良好細胞：透明度大，折光性強，輪廓不清。生長狀態(tài)不良時，細胞折光性變?nèi)?，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡，脂滴，顆粒樣物質(zhì)，細胞之間空隙加大。3、微生物污染：培養(yǎng)液顏色與透明度：培養(yǎng)液混濁，液體內(nèi)漂菌絲或細胞菌。支原體污染，沒有明顯癥狀，但細胞生長卻明顯變緩。細胞培養(yǎng)的污染和檢測細胞污染的種類細菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源無菌操作技術(shù)不當操作室環(huán)境不佳污染之血清污染之細胞

細菌培養(yǎng)液被洋蔥佰克霍爾德菌污染了。洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌。白色念珠菌污染

真菌感染

支原體污染電鏡照片,煎蛋狀和其他形狀3、細胞傳代（貼壁細胞）：1.吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2.加入0.5-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準），然后兩種方式處理：一種30S后，吸去消化液，剩余的酶液繼續(xù)作用，后在相差顯微鏡下觀察。第二種，不吸去消化液，靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果胞質(zhì)回縮，細胞變圓，相互之間不再連接成片.3.吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培養(yǎng)液。4.用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液(按順序)。然后離心沉淀細胞。5.吸取1:2-5細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。6.加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。7.將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、細胞凍存、復蘇和運輸

凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。低溫保護劑的應用常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞凍存方法1、預先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基10%DMSO2、取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1×106～5×106細胞/ml)3、加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。冷凍保存要點：冷凍過程要緩慢。4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。細胞復蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～~38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的5-10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。細胞運輸：（1）長距離運輸（幾天）選擇生長良好細胞，換細胞液，補充新培養(yǎng)液至瓶頸部，保留微量空氣，擰緊瓶蓋，瓶子口用膠密封，并用棉花包，放在攜帶者貼身口袋帶回，或用包裝盒空運。（2）短距離運輸（幾小時）去掉大部分生長液，僅留少量液體覆蓋單層細胞，防止細胞干燥，將細胞附著面朝上帶回。（3）液氮凍存運輸5、細胞活力檢測在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力。應用：由組織中分離細胞復蘇后的細胞藥物篩選方法：細胞計數(shù)+臺盼蘭染色

MTT法（1）細胞計數(shù)

將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置3分鐘。鏡下觀察計數(shù)細胞濃度的計算：Volume(體積)=長x寬x深度=1mmx1mmx0.1mm=0.1mm3=1x10-4cm3(ml)細胞密度(個/mL)=4個大方格的細胞總數(shù)/4

÷10-4=4個大方格的細胞總數(shù)/4

×104（2）臺盼蘭排斥染色原理：死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見蘭色的細胞，活細胞不被染色，呈透明狀。步驟：制備單細胞懸液，并適當稀釋（105/ml）9滴細胞懸液+1滴0.4%臺盼蘭染液，混勻染色。吸取少許懸液涂于計數(shù)板上。3分鐘內(nèi)計數(shù)活細胞和死細胞細胞數(shù)/ml＝（4大格細胞數(shù)之和/4）×104×稀釋倍數(shù)

細胞活力（％）＝未著色細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100％(3)四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）：噻唑藍原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與活細胞數(shù)成正比。優(yōu)點：簡單快速、靈敏、經(jīng)濟應用:新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。操作流程：細胞接種96孔板（200ul，103-104/孔）貼壁后加處理因素加入MTT20ul（5mg/ml）,培養(yǎng)4h酶標儀檢測0D值（波長490nm）吸出培養(yǎng)液，加入DMSO150ul,搖床震蕩10min注意事項選擇適當?shù)募毎臃N濃度，保證細胞培養(yǎng)結(jié)束時濃度不至于過滿種板技術(shù)：均勻?qū)嶒灂r應設(shè)置調(diào)零孔，溶媒孔，加藥孔。調(diào)零孔：培養(yǎng)基、MTT、DMSO。（無細胞）溶媒孔：培養(yǎng)液、MTT、DMSO、細胞、溶酶加藥孔：培養(yǎng)液、MTT、DMSO、細胞、不同濃度的藥物（一般5-7個梯度，設(shè)3-5個復孔）避免血清干擾：一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行。邊緣效應：周邊孔加入PBS6、細胞周期檢測流式細胞術(shù)PI染色細胞周期:細胞每一次分裂增殖的周期流式細胞術(shù)PI染色檢測細胞周期原理：碘化丙錠（PI）可與細胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合,采用RNA酶將RNA消化后,通過流式細胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量的多少。通過流式細胞術(shù)PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時,可以區(qū)分細胞周期各時相：G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N)S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間應用：通過流式細胞儀分析各時期的細胞百分數(shù)，可檢測細胞的增殖周期。

增加膜通透性消化RNA7、細胞凋亡的檢測凋亡形態(tài)學特征●細胞體積變小，胞質(zhì)濃縮?！癜そY(jié)構(gòu)完整，有泡狀突起?！窈巳旧|(zhì)濃縮，聚集核膜周圍?！窦毎?nèi)陷形成凋亡小體(Apoptoticbodies)?！駸o內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應。

形態(tài)學鑒定細胞膜結(jié)構(gòu)改變分析

胞膜通透性增加：改變細胞對一些核染料物質(zhì)（DAPI、Hoechst、PI）的通透性，利用著色結(jié)果的差異區(qū)別檢測壞死和凋亡細胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PS）外翻到膜表面：

AnnexinV法常用方法有：DAPI、Hoechst、PI單染、Heochst/PI雙染、Annexin-V/PI雙染等。DAPIDAPI是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料。與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)Hoechst染色Hoechst為膜通透性核酸染料，DNA結(jié)合型熒光染料,可以嵌合到堿基分子能進入正常細胞，凋亡細胞的胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染凋亡細胞PI（PropidiumIodide,

碘化丙啶）是一種常用的細胞核熒光染色劑。它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅將Annexin-V、Heochst與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來Heochst/PI雙染凋亡細胞膜通透性增高，Hoechst熒光（藍色）強度增高PI不能進入細胞膜完整的活細胞中：正常細胞和凋亡細胞拒染，壞死細胞由于失去膜完整性可染（紅色）。磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）在細胞凋亡的早期可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面Annexin-V是一種Ca2依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC）或biotin標記，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。AnnexinV/PI雙染色法8、細胞凋亡的流式分析利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)。流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）:流式細胞儀工作原理經(jīng)熒光染色的細胞從噴嘴中高速噴出，通過一個聚焦的光源進而通過各種光敏元件測量這些細胞發(fā)射的散射光和熒光，經(jīng)計算機處理得到多種信息參數(shù)信號檢測--散射光前散射光（FSC)與細胞的大小有關(guān)側(cè)散射光(SSC)反映細胞內(nèi)的顆粒多少信號檢測--熒光信號X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系

Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率流式細胞儀檢測細胞凋亡常用的三種方法

（一）PI單染色法（二）Heochst33342/PI雙染色法（三）AnnexinV/PI雙染色法PI單染色法Heochst33342/PI雙染色法

凋亡細胞膜通透性增高，Hoechst33342熒光（藍色）強度增高PI不能進入細胞膜完整的活細胞中：正常細胞和凋亡細胞拒染，壞死細胞由于膜完整性可染（紅色）。

區(qū)別正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞：正常細胞：低藍光/低紅光凋亡細胞：高藍光/低紅光壞死細胞：高藍光/高紅光AnnexinV/PI雙染色法

AnnexinV/PI雙染色法左下象限:活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限:壞死細胞（FITC+/PI+）右下象限:凋亡細胞（FITC+/PI-）細胞培養(yǎng)常見問題解答：3、為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。

4、培養(yǎng)細胞生長減慢可能原因：由于更換不同培養(yǎng)液或血清比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗增加起始培養(yǎng)細胞濃度培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子