用電化學(xué)方法還原石墨烯修飾玻碳電極來同時(shí)測(cè)定鳥嘌呤和腺嘌呤專業(yè)：無(wú)機(jī)化學(xué)摘要

在本文中,我們?cè)陔娀瘜W(xué)方法還原石墨烯氧化物（er-GO）修飾玻碳電極(er-GCE)基礎(chǔ)上研究了直接用電化學(xué)氧化、微分脈沖伏安法(DPV)來測(cè)定鳥嘌呤和腺嘌呤。和GCE、GO/GCE電極相比，這種er-GCE電極顯示出了對(duì)鳥嘌呤和腺嘌呤非常好的電催化活性，使氧化電流升高，氧化電位負(fù)移。使用準(zhǔn)備好的er-GCE成功的實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)鳥嘌呤和腺嘌呤的測(cè)定。鳥嘌呤和腺嘌呤的檢出限(基于S/N=3)分別為1.5×10－7mol/L和2.0×10－7mol/L。此外,這種er-GO/GCE顯示出了高的選擇性,再生性和穩(wěn)定性,也可以用于鳥嘌呤和腺嘌呤在熱變性小牛胸腺DNA和尿液中的檢測(cè),這顯示出了其在實(shí)際樣品分析中大有前途。實(shí)驗(yàn)1石墨烯氧化物/玻碳電極的制備

通過改進(jìn)的Hummers法使用石墨粉作為原材料來制備氧化石墨。用超聲波法將剝落的石墨氧化物變成石墨烯氧化物(GO)，是通過JY92-IIN超聲波清潔器(寧波,中國(guó))工作40分鐘(200W)得到的。這種均勻的GO（1.0mg/mL）水分散液是用于制備修改電極的。在修飾前，將裸GCE在濕潤(rùn)的Al2O3(0.05μm)上拋光成鏡面，然后用無(wú)水乙醇、蒸餾水超聲波清洗。用微量進(jìn)樣器取5μL石墨烯懸浮液滴加在玻碳電極表面，在紅外燈下烘干30分鐘即制得石墨烯修飾玻碳電極。隨后,將修飾電極放在0.1mol/LPBS(pH值為4.6)溶液中，電勢(shì)范圍從0.0到-1.5V在掃描以0.05V/s的掃描速度循環(huán)十個(gè)周期，記錄循環(huán)伏安圖。2設(shè)備和程序

GO表面形態(tài)的特點(diǎn)是通過原子力顯微鏡(AFM,Agilent5500,美國(guó))和掃描電子顯微鏡(SEM、日立H-9000、日本)得到的。所有的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)都是在三電極電解池下進(jìn)行的。包括CHI660D電化學(xué)工作站(Chenhua,中國(guó)),鉑電極和Ag/AgCl電極分別作為輔助電極和參比電極。修飾電極的電化學(xué)性質(zhì)是通過循環(huán)伏安法(CV)和電化學(xué)阻抗譜(EIS)來測(cè)定的。CV是在0.1mol/L氯化鉀+1.0×10-3mol/LK3Fe(CN)63-/4-溶液中測(cè)定。EIS是在0.1mol/L氯化鉀+5.0×10-3mol/LK3Fe(CN)63--/4-溶液中測(cè)定的。這時(shí)的平衡電勢(shì)是0.175V(vs.Ag/AgCl)、擾動(dòng)振幅為5mV，頻率范圍從100千赫至0.1赫茲。所有測(cè)量是在室溫下進(jìn)行的(25±2℃)。結(jié)果與討論1修飾電極的特征2鳥嘌呤和腺嘌呤在er-GO/GCE電極上的電化學(xué)行為3在GO/GCE上同時(shí)測(cè)定腺嘌呤和鳥嘌呤4er-GO/GCE選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性5er-GO/GCE的分析應(yīng)用1修飾電極的特征

圖1-A顯示了GO沉積在云母基質(zhì)上的AFM圖象?？梢钥闯鯣O幾乎是單層,平均厚度是1-1.5納米,比理論預(yù)測(cè)值大些。這種現(xiàn)象可以歸結(jié)為單個(gè)石墨烯薄片在兩面都包含官能團(tuán)。圖1-B顯示了GO的SEM圖像。這個(gè)皺巴巴的,皺片狀的結(jié)構(gòu)可以提供更多的反應(yīng)位點(diǎn)。此外,因?yàn)樵谥苽涫趸镞^程中的氧化反應(yīng)，石墨烯薄片邊緣的平面也可能產(chǎn)生化學(xué)官能團(tuán),如C-OH和-COOH,有利于GO吸附在GCE電極表面上和反應(yīng)物分子的吸收。圖2-A顯示了樣品GCE,GO/GCE和er-GO/GCE在0.1mol/L氯化鉀+1×10-3mol/LK3Fe(CN)6溶液中的CV圖。有明確定義的樣品的CV圖,即在裸GCE電極上觀察得到氧化還原過程中可逆電子的轉(zhuǎn)移(曲線a)。然而，修飾的GO/GCE,陽(yáng)極和陰極峰幾乎消失(曲線b)。在電極表面上Fe(CN)63-電子轉(zhuǎn)移過程中，GO修飾電極充當(dāng)了阻擋層的角色。然而,當(dāng)GO還原成er-GO時(shí)，我們可以看到一對(duì)清晰的氧化還原峰（曲線c）。表明er-GO可以加速Fe(CN)63-電子傳遞。Fig.1AFM(A)andSEM(B)imagesofGO圖2-A

樣品GCE,GO/GCE和er-GO/GCE在0.1mol/LKCl+1×10-3mol/LK3Fe(CN)6溶液中的CV圖圖2-B（a）GCE、（b）GO/GCE、（c）er-GO/GCE在5×10-3mol/LFe(CN)63-/4-+0.1mol/LKCl頻率從0.1Hz到100Hz的奈奎斯特圖圖3（a）GCE、（b）GO/GCE、（d）er-GO/GCE在1.0×10-5mol/L鳥嘌呤（A）和腺嘌呤（B）溶液中的CV圖，（c）er-GO/GCE在0.1mol/LPBS溶液（pH=6.2）在0.1V/s的CV圖圖4(a)GCE,(b)GO/GCE,和(d)er-GO/GCE在1.0×10-5mol/L鳥嘌呤和腺嘌呤混合溶液(1:1)的CV圖

，(c)er-GO/GCE在0.1mol/LPBS(pH=6.2)在0.1V/s的CV圖

Fig.5(A)在5.0×10-6mol/L腺嘌呤存在時(shí)，er-GO/GCE在0.4,0.8,2.0,4.0,8.0,12.0,和16.0×10-6mol/L鳥嘌呤(從a到g)溶液的DPV圖，坐標(biāo)是峰電流對(duì)鳥嘌呤濃度(B)在5.0×10-6mol/L鳥嘌呤存在時(shí)，er-GO/GCE在0.6,1.0,3.0,5.0,7.0,10.0,15.0,and20.0×10-6mol/L腺嘌呤(從a到h)溶液

的DPV圖，坐標(biāo)是峰電流對(duì)腺嘌呤濃度。2鳥嘌呤和腺嘌呤在er-GO/GCE電極上的電化學(xué)行為

鳥嘌呤和腺嘌呤在電極上的氧化還原行為是通過CV圖來

表征的。和鳥嘌呤在GO/GCE電極上的氧化峰相比(曲線

b),er-GO/GCE(曲線c)的峰電勢(shì)從0.754V降低到0.717V,峰電流1.349uA增加到4.976uA。氧化峰電勢(shì)負(fù)移約46mV。氧化峰值電流(Ipa)增加約4.62倍。腺嘌呤在不同電極也是類似的結(jié)果。在er-GO/GCE上峰電流增加和峰電勢(shì)負(fù)移也許可以歸因于er-GO固定在GCE電極表面時(shí)，表面積大,有大量的官能團(tuán)和導(dǎo)電性能強(qiáng)，增加了電化學(xué)吸附位點(diǎn),吸附了大量的鳥嘌呤和腺嘌呤,電催化能力大大提高。3在GO/GCE上同時(shí)測(cè)定腺嘌呤和鳥嘌呤

圖4顯示了含有0.1mol/LPBS（pH=6.2）的腺嘌呤和鳥嘌呤混合溶液（1.0×10-5mol/L）在不同電極上的CV曲線圖。在裸GCE電極上測(cè)定時(shí)可以看到兩個(gè)小駝峰峰值分別在0.790V和1.077V(曲線a）。對(duì)于GO/GCE,峰電流大約在0.754V和1.052V(曲線b)，均略有增加。相應(yīng)地,對(duì)于er-GO/GCE，峰電流大約在0.735V和1.007V，不僅顯示出了電勢(shì)負(fù)移而且電流響應(yīng)增強(qiáng)。陽(yáng)極峰電勢(shì)擴(kuò)大后的分離與敏感性的增加實(shí)現(xiàn)了在er-GO/GCE上同時(shí)測(cè)定鳥嘌呤和腺嘌呤的可行性。

在優(yōu)化條件下，用電化學(xué)方法在er-GO/GCE上同時(shí)測(cè)定鳥嘌呤和腺嘌呤由DPV完成。為了優(yōu)化決定性條件，GO修飾數(shù)量的影響、溶液的pH值影響被優(yōu)先考慮。實(shí)驗(yàn)證明,當(dāng)GO分散液在GCE電極上的體積，從1到5微升時(shí)和從5到9微升時(shí)，鳥嘌呤和腺嘌呤在er-GO/GCE的氧化電流分別增加和降低。另外,研究還表明,當(dāng)溶液的pH值從4.6變化到6.2時(shí)，鳥嘌呤和腺嘌呤的氧化峰電流增加,從6.2到8.7時(shí)，氧化峰電流降低。因此，分別選用GO的修飾體積為5毫升、溶液pH值為6.2作為優(yōu)化條件。4er-GO/GCE選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

同時(shí)測(cè)定鳥嘌呤和腺嘌呤時(shí)主要的干擾物質(zhì)來自生物體液中共存的物質(zhì),這可能導(dǎo)致新的伏安峰或與現(xiàn)有的峰重疊。我們對(duì)一些可能的無(wú)機(jī)離子和有機(jī)化合物進(jìn)行了測(cè)試并評(píng)估它們的干擾水平。結(jié)果表明,50倍濃度的Ca2+,Mg2+,Fe3+,Zn2+、Cu2+,Cl-,抗壞血酸、尿液酸、多巴胺、葡萄糖、和10倍的退熱凈,人血清白蛋白,血紅蛋白對(duì)鳥嘌呤和腺嘌呤信號(hào)的檢測(cè)沒有明顯的影響，偏差低于±5%。er-GO/GCE穩(wěn)定性和重現(xiàn)性的評(píng)估是在1.0×10-5mol/L的鳥嘌呤和1.0×10-5mol/L的腺嘌呤溶液中進(jìn)行的。經(jīng)過7天成功的掃描檢測(cè)，鳥嘌呤和腺嘌呤溶液在新制的er-GO/GCE上的氧化峰電流有一個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.42%和2.75%。如將新制的er-GO/GCE儲(chǔ)存在4℃下7天，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.87%和4.06%。表明這種準(zhǔn)備好的er-GO/GCE具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。此外,在PBS溶液中連續(xù)掃描三個(gè)周期,結(jié)果顯示er-GO/GCE很容易再生并為下一個(gè)測(cè)量使用,再生er-GO/GCE在相同的溶液中測(cè)量15次，RSD值約2.7%。5er-GO/GCE的分析應(yīng)用

通過er-GO/GCE測(cè)定包含在熱變性小牛胸腺DNA(5mg/mL)中的鳥嘌呤和腺嘌呤。氧化鳥嘌呤和腺嘌呤對(duì)應(yīng)的兩個(gè)氧化峰可以在DPV中清楚地觀察到。鳥嘌呤和腺嘌呤的濃度是通過標(biāo)準(zhǔn)加入法來確定的。腺嘌呤和鳥嘌呤在熱變性小牛胸腺DNA含量的理論值和計(jì)算值分別為22.6%和28.5%(摩爾比,mol%)。這個(gè)值(G+C)/(A+T)計(jì)算為0.793,這與標(biāo)準(zhǔn)值0.77相一致。此外,為了進(jìn)一步確認(rèn)這種方法的實(shí)用性,er-GO/GCE也被應(yīng)用于鳥嘌呤和腺嘌呤在尿液中的測(cè)定。所有的樣品都確定在同等條件下的5倍。結(jié)果列在表2中，可以看出回收率是可觀的。鳥嘌呤和腺嘌呤回收率分別是98.0-104.0%和98.0-102.0%，這也表明這種方法的適用性和可靠性。結(jié)論

總之，在基于石墨烯修飾GCE電極上一個(gè)簡(jiǎn)單和環(huán)保

的對(duì)鳥嘌