微生物的分離和純培養(yǎng)第一頁，共一百頁，2022年，8月28日七、微生物的保藏技術(shù)菌種保藏的原理：根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。例如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等條件，使菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)。第二頁，共一百頁，2022年，8月28日傳代培養(yǎng)保藏冷凍保藏干燥保藏紙片保藏薄膜保藏寄主保藏微生物菌株保藏的方法：第三頁，共一百頁，2022年，8月28日傳代保藏斜面、半固體瓊脂柱、液體傳代培養(yǎng)保藏斜面：可保存數(shù)周至數(shù)年，可用石蠟或橡皮塞封口，低溫延長保存時間液體：菌苔制成菌懸液，低溫（懸液保藏法）缺點：繁瑣、易污染、變異喪生原有特性第四頁，共一百頁，2022年，8月28日冷凍保藏液氮保藏、低溫冰箱等液氮可達－196℃，效果較好注意：速凍，減少冰晶損傷細(xì)胞冷凍保藏法細(xì)胞體積大的要比體積小的對低溫更敏感；無細(xì)胞壁的比有細(xì)胞壁的更敏感。第五頁，共一百頁，2022年，8月28日干燥保藏沙土管保藏、冷凍真空干燥保藏沙土管：產(chǎn)孢子菌。制成孢子懸液，加無菌沙土管，減壓抽干水分，石蠟封口，冰箱保存。冷凍真空干燥：加保護劑樣品預(yù)先冷凍，真空冰升華去水，低溫保存，保存數(shù)十年，目前最普遍、最重要的方法，菌種保藏中心多采用此法。菌種保藏時采用不同手段保藏，防止某種方法失敗導(dǎo)致菌種喪失。干燥保藏法第六頁，共一百頁，2022年，8月28日標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存使用

1.長期保存的儲存菌株以冷凍干燥保藏為主，特殊要求的菌種可用其它方法進行保存，保存期可長達幾年至幾十年。

2.半儲存菌株以含20%甘油的肉湯或液體石臘封存的半固體瓊脂為主，在0℃以下保存，保存期為3－6個月。

3.應(yīng)用菌株以瓊脂斜面為主，在4℃保存，保存期為1－3個月。

4.菌種的傳代不可超過6次。視菌種的特性及使用情況，一般儲存菌株每5年傳記代一次，每1-2年從儲存菌株轉(zhuǎn)接至半儲存菌株，半儲存菌株每3-6個月傳代一次，每1-3個月從半儲存菌株轉(zhuǎn)接接至應(yīng)用菌株。

5.每次檢驗用的菌株必須是從應(yīng)用菌株轉(zhuǎn)接的新鮮菌株。每支應(yīng)用菌株用兩次后必須銷毀（121℃，0.1MPa高壓滅菌處理15分鐘以上）。

第七頁，共一百頁，2022年，8月28日國內(nèi)外菌種保藏部分情況我國于1979年7月成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM).該委員會下設(shè)6個菌種保藏管理中心,其負(fù)責(zé)單位、代號及保藏菌種的性質(zhì)如下:

第八頁，共一百頁，2022年，8月28日普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)--中科院微生物所,北京(AS),真菌、細(xì)菌;中科院武漢病毒研究所,武漢(AS-IV),病毒。農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)---中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所,北京(ISF)。工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)---輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所,南京(ID),真菌;衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所,北京(NICPBP),細(xì)菌；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所,北京(IV),病毒。第九頁，共一百頁，2022年，8月28日抗菌素菌種保藏管理中心(CACC)---中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所北京(IA)；四川抗菌素工業(yè)研究所,成都(SIA),新抗菌素菌種;華北制藥廠抗菌素研究所,石家莊(IANP),生產(chǎn)用抗菌素菌種。獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)---農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京(CIVBP)。除了上述保藏中心外,我國從事微生物研究并保藏有一定數(shù)量各類專業(yè)用微生物菌種的科研單位、大專院校還有近百所。

第十頁，共一百頁，2022年，8月28日世界55個國家的菌種保藏機構(gòu)共352個,目前主要的菌種保藏機構(gòu)有:美國的“美國典型菌種收藏所”(ATCC)，保藏方式主要采用冷凍干燥和液氮超低溫凍結(jié)法。美國“農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部菌種收藏所”(ARS)設(shè)立在“北方地區(qū)研究室”(NRRL);荷蘭“真菌中心收藏所”(CBS);日本“大阪發(fā)酵研究所”(IFO);法國“里昂巴斯德研究所”(IPL);西德“柯赫研究所”(RKI);蘇聯(lián)“蘇聯(lián)科學(xué)院微生物研究所”(IM)。第十一頁，共一百頁，2022年，8月28日作業(yè)1、名詞解釋：無菌技術(shù)、單細(xì)胞分離

2、一般可用哪些方法獲得微生物的純培養(yǎng)物？

第十二頁，共一百頁，2022年，8月28日上節(jié)課知識回顧微生物分離純化方法用固體培養(yǎng)基分離、純培養(yǎng)稀釋倒平板法涂布平板法平板劃線法稀釋搖管法用液體培養(yǎng)基分離、純培養(yǎng)單孢子分離選擇培養(yǎng)分離二元培養(yǎng)物第十三頁，共一百頁，2022年，8月28日第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)

無菌技術(shù)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)單細(xì)胞（單孢子）分離選擇培養(yǎng)分離第十四頁，共一百頁，2022年，8月28日一、無菌技術(shù)

無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)(物)時防止其被其他微生物污染的技術(shù)。

第十五頁，共一百頁，2022年，8月28日保持無菌的方法

高壓蒸氣滅菌高溫干熱滅菌棉塞超凈工作臺等

第十六頁，共一百頁，2022年，8月28日接種操作

第十七頁，共一百頁，2022年，8月28日二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

菌落：單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體。菌苔：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔。第十八頁，共一百頁，2022年，8月28日第十九頁，共一百頁，2022年，8月28日菌落菌落或菌苔是對微生物進行分類和鑒定的重要依據(jù)。細(xì)菌菌落特征剖面圖第二十頁，共一百頁，2022年，8月28日細(xì)菌菌落特征正面圖菌落第二十一頁，共一百頁，2022年，8月28日培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板（平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。

第二十二頁，共一百頁，2022年，8月28日平板分離微生物純培養(yǎng)技術(shù)

稀釋倒平板法

涂布平板法

平板劃線分離法

稀釋搖管法

第二十三頁，共一百頁，2022年，8月28日1、稀釋倒平板法：無菌水、梯度稀釋、50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基、滅過菌的培養(yǎng)皿。注意要稀釋得當(dāng)。分離出單個菌落以后，重復(fù)上述操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。第二十四頁，共一百頁，2022年，8月28日Pourplate稀釋倒平板法第二十五頁，共一百頁，2022年，8月28日涂布平板法Spreadplate無菌水、梯度稀釋涂布平板第二十六頁，共一百頁，2022年，8月28日稀釋倒平板法和涂布平板法第二十七頁，共一百頁，2022年，8月28日平板劃線分離法第二十八頁，共一百頁，2022年，8月28日稀釋搖管法用于分離嚴(yán)格厭氧菌。先將一系列盛有無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基與空氣隔開。

第二十九頁，共一百頁，2022年，8月28日三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

用于細(xì)胞大的細(xì)菌、原生動物和藻類等的純化分離。稀釋法：經(jīng)高度稀釋后，同一個稀釋度的試管中大多數(shù)（95%以上）表現(xiàn)不生長，很可能得到的是純培養(yǎng)。

第三十頁，共一百頁，2022年，8月28日四、單細(xì)胞（單孢子）分離

單細(xì)胞分離：采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個體的大小成反比。個體較大的可在低倍顯微鏡下進行，個體較小的則需采用顯微操作儀。第三十一頁，共一百頁，2022年，8月28日五、選擇培養(yǎng)分離

當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其他微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的，故需采用選擇培養(yǎng)分離法。第三十二頁，共一百頁，2022年，8月28日1、利用選擇培養(yǎng)基進行直接分離

如要分離高溫菌，可在高溫條件進行培養(yǎng)；要分離某種抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上進行分離。

第三十三頁，共一百頁，2022年，8月28日2、富集培養(yǎng)主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件：物理、化學(xué)和生物等。以從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸的微生物的實驗為例。第三十四頁，共一百頁，2022年，8月28日六、微生物的保藏技術(shù)

保藏期間微生物不死亡、不污染、不會因發(fā)生而丟失重要的生物學(xué)性狀。許多國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏委員會美國典型菌種保藏中心世界菌種保藏聯(lián)合會等

第三十五頁，共一百頁，2022年，8月28日菌種保藏菌種保藏：就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。

對于生產(chǎn)中使用的菌種保藏培養(yǎng)基，要求比較豐富的氮源，以防止菌種退化變質(zhì)。第三十六頁，共一百頁，2022年，8月28日菌種保藏方法連續(xù)移接改變條件（干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)等）使菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保藏，有的可保藏幾十年或更長的時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。

第三十七頁，共一百頁，2022年，8月28日1、傳代培養(yǎng)保藏是微生物保存的基本方法。瓊脂斜面、半固體瓊脂柱和液體培養(yǎng)等。橡皮塞封口或用石蠟覆蓋，并放置低溫保存。4℃保存。第三十八頁，共一百頁，2022年，8月28日2、冷凍保藏代謝作用停止。細(xì)胞體積大者要比小者對低溫更敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁敏感。其原因是低溫會使細(xì)胞內(nèi)水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞，尤其是細(xì)胞膜的損傷。速凍及快速解凍可減少損傷；還可加一些保護劑，如0.5%左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過降低強烈的脫水作用而保護細(xì)胞；大分子物質(zhì)因此在采用冷凍法保藏菌種時，一般應(yīng)加入各種保護劑以提高培養(yǎng)物的存活率。第三十九頁，共一百頁，2022年，8月28日3、干燥保藏法沙土管保存和冷凍真空干燥保藏是最常用的二項微生物干燥保藏技術(shù)。第四十頁，共一百頁，2022年，8月28日沙土管保存一般將菌種接種至斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸浮液，加入無菌沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、橡膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等，保藏時間相對較長。第四十一頁，共一百頁，2022年，8月28日冷凍真空干燥保藏是將加有保護劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過水的升華作用除去水分。達到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達到長期保藏的目的。用水升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對比較小，存活率及保藏效果均不錯，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。第四十二頁，共一百頁，2022年，8月28日第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)

顯微鏡的種類及原理

顯微觀察樣品的制備

第四十三頁，共一百頁，2022年，8月28日一、顯微鏡的種類及原理

普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡

第四十四頁，共一百頁，2022年，8月28日普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡普通生物顯微鏡由三部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成。機械裝置：保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配制，用于固定材料和觀察方便。第四十五頁，共一百頁，2022年，8月28日分辨率重要性能參數(shù)。顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨率（resolution）有關(guān)。分辨率是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力。分辨率的大小決定于光的波長和鏡口角以及介質(zhì)的折射率。第四十六頁，共一百頁，2022年，8月28日分辨率肉眼分辨率一般只有0.25mm光學(xué)顯微鏡分辨率0.18μm電子顯微鏡可達0.2nmR=0.5λ/ｎsinα/2式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對物鏡鏡口的張角），ｎsinα/2

=鏡口率介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66第四十七頁，共一百頁，2022年，8月28日二、顯微觀察樣品的制備

要根據(jù)顯微鏡和樣品的特點來制備。主要講述光學(xué)顯微鏡的制樣。

第四十八頁，共一百頁，2022年，8月28日1、活體觀察壓滴法：將菌懸液滴于載玻片上，加蓋蓋玻片后立即進行顯微鏡觀察。懸滴法：在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上后進行顯微鏡觀察，為防止液滴蒸發(fā)變干，一般還應(yīng)在蓋玻片四周加封凡士林。菌絲埋片法：將無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對菌絲的形態(tài)進行觀察。插片法：

第四十九頁，共一百頁，2022年，8月28日2、染色觀察固定的目的：殺死細(xì)菌并使菌體粘附于坡片上。增加細(xì)菌對染料的親和力。常用的方法有酒精燈火焰加熱和化學(xué)固定二種。

第五十頁，共一百頁，2022年，8月28日細(xì)菌染色法死菌正染色負(fù)染色：簡單染色法鑒別染色法

革蘭氏染色法抗酸性染色法芽孢染色法莢膜染色法等活菌:用美藍或TTC（氯化三苯基四氮唑）等作活菌染色姬姆薩染色法染色觀察第五十一頁，共一百頁，2022年，8月28日第三節(jié)顯微鏡下的微生物

微生物類群包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類，這里主要介紹細(xì)胞型微生物。

細(xì)菌和古生菌

真菌

藻類

原生動物

第五十二頁，共一百頁，2022年，8月28日一、細(xì)菌和古生菌

細(xì)菌的形態(tài)和排列古生菌原核生物的細(xì)胞大小

第五十三頁，共一百頁，2022年，8月28日1、細(xì)菌的形態(tài)和排列球菌(Coccus)桿菌(Bacillus)螺旋菌(Spirlla)其他形狀的細(xì)菌第五十四頁，共一百頁，2022年，8月28日第五十五頁，共一百頁，2022年，8月28日球菌(coccus)單球菌雙球菌四聯(lián)球菌八疊球菌葡萄球菌鏈球菌第五十六頁，共一百頁，2022年，8月28日ArrangementofSphericalBacterialCellsdiplococci

streptococci

tetracocci

sarcinae

staphylococci

第五十七頁，共一百頁，2022年，8月28日.................................................單球菌（顯微鏡下示意圖）單球菌(singlecoccus)第五十八頁，共一百頁，2022年，8月28日......................................................................雙球菌（顯微鏡下示意圖）雙球菌(doublecoccus)第五十九頁，共一百頁，2022年，8月28日Micrococcus–aerobic,gram-positive,cellarrangesmainlyinpairs,orirregularclusters.Theyareoftenyellow,orangeorredincolour第六十頁，共一百頁，2022年，8月28日上：顯微鏡效果下：電鏡照片四聯(lián)球菌(Micrococcuslactis)第六十一頁，共一百頁，2022年，8月28日八疊球菌(Sarcinaureae)八疊球菌（顯微鏡下示意圖）第六十二頁，共一百頁，2022年，8月28日葡萄球菌左：電鏡照片右：顯微鏡下的金黃色葡萄球菌葡萄球菌(Staphylococcusaureus)第六十三頁，共一百頁，2022年，8月28日Staphylococcus-facultativelyanaerobic,gram-positive,usuallyformirregularclusters,nonmotile,catalasepositivebutoxidasenegative,fermentglucoseanaerobically.staphylococcistaphylococci第六十四頁，共一百頁，2022年，8月28日鏈球菌鏈球菌（顯微鏡下示意圖）第六十五頁，共一百頁，2022年，8月28日鏈球菌（電鏡照片）第六十六頁，共一百頁，2022年，8月28日Streptococcus-facultativelyanaerobicormicroaerophilic,catalasenegative,gram-positive,Cellarrangesinpairsorchains,usuallynonmotile,

Afewspeciesareanaerobicratherthanfacultative.第六十七頁，共一百頁，2022年，8月28日

電子顯微鏡下的結(jié)核菌（綠色的就是結(jié)核桿菌）桿菌第六十八頁，共一百頁，2022年，8月28日動物宿主細(xì)胞感染桿菌瀕臨死亡

電鏡照片第六十九頁，共一百頁，2022年，8月28日鏈桿菌第七十頁，共一百頁，2022年，8月28日鏈顯微鏡下的鏈桿菌第七十一頁，共一百頁，2022年，8月28日螺旋菌（Spirlla)弧菌(vibrio)螺菌（spirllum）螺旋體(spirochaeta)第七十二頁，共一百頁，2022年，8月28日Vibrio,SpirillumandSpirochetevibriospirillumspirochete第七十三頁，共一百頁，2022年，8月28日第七十四頁，共一百頁，2022年，8月28日顯微鏡下的螺旋菌第七十五頁，共一百頁，2022年，8月28日幽門螺旋菌左：顯微數(shù)碼攝像右：結(jié)構(gòu)示意圖第七十六頁，共一百頁，2022年，8月28日放線菌的分布與生活方式放線菌一般分布在含量較低；有機物豐富和呈微生物堿性的土壤中。107個／g左右能看到：北方春季深層黑土地的白絲能聞到：泥土特有的“泥腥味”第七十七頁，共一百頁，2022年，8月28日第七十八頁，共一百頁，2022年，8月28日ChainofconidiosporesAgarsurfaceSubstratemyceliumAerialhyphaeVarioustypesofspore-bearingstructuresonthestreptomyces第七十九頁，共一百頁，2022年，8月28日放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)（模式圖）氣生菌絲孢子絲分生孢子基內(nèi)菌絲固體基質(zhì)第八十頁，共一百頁，2022年，8月28日基內(nèi)菌絲（Substratemycelium)

um長度100－600um，色素可有可無?；鶅?nèi)菌絲放線菌第八十一頁，共一百頁，2022年，8月28日氣生菌絲（Aerialmycelium)

基內(nèi)菌絲長到一定時期，長出培養(yǎng)基外，伸向空間的菌絲，直徑1－1.4um,長短不一，形狀不一，顏色較深。氣生菌絲第八十二頁，共一百頁，2022年，8月28日孢子絲(Reproductivemycelium)

當(dāng)氣生菌絲生長發(fā)育到一定階段，氣生菌絲上分化出的可形成孢子的菌絲。孢子的形狀及在氣生菌絲上排列的方式隨種而異。第八十三頁，共一百頁，2022年，8月28日Varioustypesofspore-bearingstructuresonthestreptomyces第八十四頁，共一百頁，2022年，8月28日放線菌孢子絲類型直形彎曲叢生成束單輪生無螺旋開環(huán)鉤形原始螺旋形松螺旋緊螺旋螺旋單輪生無螺旋兩級輪生螺旋兩級輪生第八十五頁，共一百頁，2022年，8月28日放線菌的菌落形態(tài)菌落質(zhì)地硬而且致密，菌落小而不廣泛延伸菌落表面呈緊密的絨狀或堅實、干燥多皺。接種針難以挑取，有時可挑碎，有時可將整個菌落挑起。第八十六頁，共一百頁，2022年，8月28日2、古生菌第八十七頁，共一百頁，2022年，8月28日細(xì)菌電子顯微鏡照片3、原核生物的細(xì)胞大小普通光學(xué)顯微鏡下用測微尺測細(xì)菌大小第八十八頁，共一百頁，2022年，8月28日細(xì)菌細(xì)胞的大小細(xì)胞的大小是細(xì)菌分類特征不同細(xì)菌細(xì)胞大小不同同一細(xì)菌的不同菌齡細(xì)胞大小不同細(xì)菌細(xì)胞大小還與營養(yǎng)等因素相關(guān)細(xì)胞大小的測量結(jié)果只是近似值或平均值第八十九頁，共一百頁，2022年，8月28日二、真菌

霉菌

酵母菌

第九十頁，共一百頁，2022年，8月28日FungiFilamentousfungi2.Unicellularfung