操作流程瓊脂糖凝膠板的制備質(zhì)粒DNA及酶切產(chǎn)物電泳（約1h）（10μl）酶切操作、保溫（1-3h）質(zhì)粒DNA提取原理與方法、實(shí)驗(yàn)操作純化的質(zhì)粒DNA（20μl）瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果觀察結(jié)果分析與問題討論9月23日9月30日DNA的紫外分光光度法定量測(cè)定第1頁/共38頁第一頁，共39頁。實(shí)驗(yàn)三：DNA的瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)四：DNA的紫外分光光度法定量測(cè)定第2頁/共38頁第二頁，共39頁。實(shí)驗(yàn)三DNA的瓊脂糖凝膠電泳第3頁/共38頁第三頁，共39頁。瓊脂糖凝膠電泳法凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料:

瓊脂糖電泳凝膠電泳

聚丙烯酰胺電泳第4頁/共38頁第四頁，共39頁。一、瓊脂糖凝膠電泳的功用

瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。

第5頁/共38頁第五頁，共39頁。二、實(shí)驗(yàn)原理：

在pH值為8.0～8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。第6頁/共38頁第六頁，共39頁。三、瓊脂糖電泳分離DNA的范圍

瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長(zhǎng)度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。第7頁/共38頁第七頁，共39頁。膠濃（%）溴酚藍(lán)二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb四、電泳指示劑：

核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenolblue,Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍(lán)慢。第8頁/共38頁第八頁，共39頁。五、影響凝膠電泳的因素在電場(chǎng)中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比。

2、瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。第9頁/共38頁第九頁，共39頁。3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)最快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)最慢。4、電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。

第10頁/共38頁第十頁，共39頁。5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。

6、離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng),在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

第11頁/共38頁第十一頁，共39頁。六、材料

前期實(shí)驗(yàn)中提取的質(zhì)粒DNA和其酶切產(chǎn)物，瓊脂糖(Agarose)七、設(shè)備

水平式電泳裝置,電泳儀,微量移液槍,微波爐或電爐,紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)。八、試劑

1、5×TBE電泳緩沖液：稱取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。

2、6×電泳載樣緩沖液：0.25％溴粉藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液（或30％甘油），貯存于4℃。

3、溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。第12頁/共38頁第十二頁，共39頁。九、操作步驟

1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。

2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。3、膠板的制備：將融化的瓊脂冷卻至50-60℃，而后到入制膠模具（預(yù)先插上樣品梳子）中，待膠完全凝固后撥出梳子，取出膠塊，放入加有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)。第13頁/共38頁第十三頁，共39頁。4、加樣：取8μlDNA樣品與2μl6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。

5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。電泳方向由負(fù)極向正極，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí),停止電泳。

6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色5-10分鐘。

7、觀察和拍照：在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。第14頁/共38頁第十四頁，共39頁。五注意事項(xiàng)1倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會(huì)使制板變形2膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點(diǎn)樣孔3點(diǎn)樣時(shí)槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多4Goodview有毒，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔5紫外線照射不要太久第15頁/共38頁第十五頁，共39頁。第16頁/共38頁第十六頁，共39頁。第17頁/共38頁第十七頁，共39頁。第18頁/共38頁第十八頁，共39頁。第19頁/共38頁第十九頁，共39頁。第20頁/共38頁第二十頁，共39頁。第21頁/共38頁第二十一頁，共39頁。123M123M123實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶切后直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，下圖是較好的酶切結(jié)果。第22頁/共38頁第二十二頁，共39頁。LC型質(zhì)粒DNA點(diǎn)樣孔細(xì)菌基因組DNAOC型質(zhì)粒DNASC質(zhì)粒DNA細(xì)菌RNA第23頁/共38頁第二十三頁，共39頁。常見問題1、提取的DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵過程反應(yīng)時(shí)間過短；離心時(shí)間或速度不夠。2、提取的DNA成涂布狀：操作過程中用力過猛，動(dòng)作粗暴；操作系統(tǒng)有污染。3、與染色體DNA分離不全；變性過程不完全；試劑配置有問題。第24頁/共38頁第二十四頁，共39頁。紫外分光光度法檢測(cè)DNA實(shí)驗(yàn)四【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

掌握752型紫外分光光度計(jì)的使用；學(xué)習(xí)用紫外分光光度法測(cè)定DNA的含量。第25頁/共38頁第二十五頁，共39頁。分光光度技術(shù)是利用物質(zhì)特有的吸收光譜對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。第26頁/共38頁第二十六頁，共39頁。特點(diǎn)靈敏度高：測(cè)定下限可達(dá)10－5～10－6mol/L準(zhǔn)確度能夠滿足微量組分的測(cè)定要求：相對(duì)誤差2～5％（1～2％）操作簡(jiǎn)便快速應(yīng)用廣泛

吸光光度法是基于被測(cè)物質(zhì)的分子對(duì)光具有選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。第27頁/共38頁第二十七頁，共39頁。光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見近紅外中紅外

遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m第28頁/共38頁第二十八頁，共39頁。電磁波譜氫燈

復(fù)合光(陽光及鎢燈)發(fā)射光譜紅

橙

黃

綠

青

藍(lán)

紫單色光三棱鏡可見光分光光度計(jì)光源紫外分光光度計(jì)光源高低第29頁/共38頁第二十九頁，共39頁。有關(guān)光學(xué)原理吸收光譜

在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液，光源發(fā)射光譜中某些波長(zhǎng)的光因溶液吸收而消失，這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。第30頁/共38頁第三十頁，共39頁。苯和甲苯在環(huán)己烷中的吸收光譜苯(254nm)甲苯(262nm)A230250270第31頁/共38頁第三十一頁，共39頁。入射光透射光反射光被物質(zhì)吸收的光第32頁/共38頁第三十二頁，共39頁。光吸收基本定律:Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760)A=lg(I0/It)=k1b比爾定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介質(zhì)厚度(cm)第33頁/共38頁第三十三頁，共39頁。Lambert-Beer定律

A或D＝KCL

吸光度摩爾消光系數(shù)吸收物質(zhì)的光徑（cm）溶液濃度（mol/L）第34頁/共38頁第三十四頁，共39頁。

原理核酸或核苷酸中的堿基共軛雙鍵對(duì)260nm紫外光有特異性吸收，吸收強(qiáng)度與核酸濃度成正比。

紫外光譜分析法第35頁/共38頁第三十五頁，共39頁。

分光光度計(jì)法定量DNA取10l樣品DNA，加入4ml0.1xTE對(duì)待測(cè)DNA樣品做1:400稀釋。0.1xTE作為空白,在波長(zhǎng)260nm、280nm、310nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)至零。根據(jù)OD值計(jì)算DNA濃度（g/ml）雙鏈DNA：[dsDNA]=50×（OD260－OD310)×稀釋倍數(shù)4、1OD雙鏈DNA濃度約為50g/ml，單鏈DNA或RNA為40、50g/ml。5.DNA的純度鑒定OD260/OD280=1.8（RNA為2.0）

>1.8可能有RNA污染

<1.8可能有蛋白質(zhì)污染第36頁/共38頁第三十六頁，共