專題1基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的。因此又叫做DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰膭e名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程主要的技術(shù)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的新生物類型和產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)一、基因工程的原理DNA重組技術(shù)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想：需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：在以上過程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因通過運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲特性二、DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞二、DNA重組技術(shù)的基本工具解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”—限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”—DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”—基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體二、DNA重組技術(shù)的基本工具⒈主要來源：⒉種類與命名：⒊作用特點(diǎn)（特異性）4.限制酶識(shí)別序列5.作用結(jié)果：1.識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列2.切割特定核苷酸序列中的特定位點(diǎn)主要從原核生物中分離純化產(chǎn)生黏性末端或平末端Goon大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成少數(shù)的識(shí)別序列由4、5或8個(gè)核苷酸組成一、限制性核酸內(nèi)切酶----分子手術(shù)刀⒉種類與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢEcoRⅠ黏性末端黏性末端（4）作用結(jié)果：

黏性末端和平末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端SmaⅠ平末端平末端Q:要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。Q:如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?限制酶的種類識(shí)別序列切割位點(diǎn)SmaⅠGGGCCCG↓CBamHⅠGGATCCG↓GSau3AGATC↓GATCHindⅢAAGCTTA↓A①

GATC

②

GGATCC

CTAG

CCTAGG③

GGGCCC

④AAGCTT

CCCGGG

TTCGAA下表是幾種限制酶的識(shí)別序列，畫出下面四種DNA片段被對(duì)應(yīng)的限制酶切割后的結(jié)果。

剪切結(jié)果：①—GATC——GATC——CTAG——CTAG—②—GGATCC——GGATCC——CCTAGG——CCTAGG—③—GGGCCC——GGGCCC——CCCGGG—

—CCCGGG—SmaⅠBamHⅠSau3A④—AAGCTT——AAGCTT——TTCGAA——TTCGAA—HindⅢ大家認(rèn)真觀察這幾個(gè)DNA片段被對(duì)應(yīng)限制酶切割后的末端的結(jié)構(gòu)，你能從中發(fā)現(xiàn)什么規(guī)律嗎？

規(guī)律：1、不同限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)不同體現(xiàn)了限制酶的作用特點(diǎn)：特異性(即：一種限制酶只能切割特定的核苷酸序列)限制酶在識(shí)別序列的中軸線兩側(cè)切割則形成黏性末端，延中軸線切割則形成平末端如：Sau3A切割①和BamHⅠ切割②4、限制酶切割DNA片段后，可能形成兩種結(jié)果：黏性末端和平末端2、同一種限制酶切割形成的末端是相同的3、不同限制酶切割DNA可能形成相同的黏性末端限制酶所識(shí)別的序列，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？實(shí)例：1、下列關(guān)于限制酶的說法正確的是（）A.限制酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少B.一種限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割DNA后都會(huì)形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵Ｂ1、種類：2、作用部位：兩類E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

磷酸二酯鍵DNA連接酶可把切下來的DNA片段拼接成新的DNA。即:把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來實(shí)質(zhì)是把脫氧核糖和磷酸連接起來.二、DNA連接酶----分子縫合針③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別二、DNA連接酶----分子縫合針尋根問底

DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?AG

T

AC

TA

A

T

DNA母鏈DNA聚合酶DNA聚合酶尋根問底TTAGATATCCGACGGTTTAA……………………………………………………DNA連接酶尋根問底思考不同點(diǎn)：DNA連接酶是將___________連接起來,模板DNA聚合酶是將___________連接起來，模板都是催化磷酸二酯鍵的形成兩個(gè)DNA片段單個(gè)核苷酸共同點(diǎn)：

不需要需要Q:外源基因(如抗蟲基因)怎樣才能導(dǎo)入受體細(xì)胞(如棉花細(xì)胞)？1.作用：2.種類：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物和動(dòng)植物病毒等。

將外源基因送入受體細(xì)胞。三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體--分子運(yùn)輸車”

最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒:常含有抗藥基因如:四環(huán)素的標(biāo)記基因。(質(zhì)粒的存在與否對(duì)受體細(xì)胞生存沒有決定性作用，但復(fù)制只能在受體細(xì)胞內(nèi)完成)

質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并且具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子質(zhì)粒是基因工程最常用的載體假如質(zhì)粒沒有限制酶切割位點(diǎn)將怎樣？（沒有限制酶能識(shí)別的序列）質(zhì)粒限制酶？限制酶？限制酶？限制酶？目的基因1.有一個(gè)或多個(gè)酶切割位點(diǎn)目的基因插入位點(diǎn)作為運(yùn)載體必須具備的條件1.有一個(gè)或多個(gè)酶切割位點(diǎn)重組DNA受體細(xì)胞受體細(xì)胞假如質(zhì)粒含有標(biāo)記基因如：四環(huán)素抗性基因含四環(huán)素的培養(yǎng)基2.具有標(biāo)記基因（四環(huán)素抗性基因、氨芐基青霉素抗性基因等）作為運(yùn)載體必須具備的條件1.有一個(gè)或多個(gè)酶切割位點(diǎn)2.具有標(biāo)記基因（四環(huán)素抗性基因、氨芐基青霉素抗性基因等）受體細(xì)胞3.能自我復(fù)制作為運(yùn)載體必須具備的條件1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存2、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接3、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）4、對(duì)受體細(xì)胞無害5、分子不能太大，否則不便于操作作為運(yùn)載體必須具備的條件小結(jié)：基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識(shí)別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒1、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識(shí)別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中課堂練習(xí)2、DNA連接酶催化的反應(yīng)是()A．DNA復(fù)制時(shí)母鏈與子鏈之間形成氫鍵B．黏性末端堿基之間形成氫鍵C．兩個(gè)DNA片段黏性末端之間的縫隙的連接D．A、B、C都不正確3、作為基因的運(yùn)輸工具——載體，必須具備的條件及理由是()A、能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因B、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于目的基因的表達(dá)C．具有某些標(biāo)記基因，以便為目的基因的表達(dá)提供條件D、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存，以便于進(jìn)行篩選4、質(zhì)粒是基因工程最常見的載體，它的主要特點(diǎn)是()①能自主復(fù)制 ②不能自主復(fù)制 ③結(jié)構(gòu)很小 ④是蛋白質(zhì) ⑤是環(huán)狀RNA ⑥是環(huán)狀DNA ⑦能“友好”地“借居”A、①③⑤⑦B、②④⑥C．①③⑥⑦D．②③⑥⑦5、在受體細(xì)胞中能檢測(cè)出目的基因是因?yàn)?)A、目的基因上有標(biāo)記B、質(zhì)粒具有某些標(biāo)記基因C、重組質(zhì)粒能夠復(fù)制D．以上都不正確6、關(guān)于質(zhì)粒的敘述正確的是()A、質(zhì)粒是能夠自我復(fù)制的環(huán)狀DNA分子B、質(zhì)粒是唯一的載體C、重組質(zhì)粒是目的基因D、質(zhì)?？稍谒拗魍鈫为?dú)復(fù)制7、基因工程中可用作載體的是()①質(zhì)粒 ②噬菌體 ③病毒 ④動(dòng)物細(xì)胞核A、①②③B、①②④C．②③④D、①③④8、下列關(guān)于基因工程中所選用的質(zhì)粒的說法，錯(cuò)誤的是()A、不能沒有