川芎嗪對(duì)大鼠移植肝的保護(hù)作用【摘要】

目的

探討川芎嗪〔TMP〕對(duì)大鼠移植肝的愛護(hù)作用。辦法

參照Delriviere和Kamada等辦法建立大鼠肝移植模型，將大鼠隨機(jī)分為3組：A組〔假手術(shù)組〕、B組〔肝移植對(duì)照組〕和C組〔TMP干涉組〕。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測術(shù)后血清肝功能(AST、ALT、LDH)水平；應(yīng)用免疫組化SP法結(jié)合病理圖像分析儀測定肝組織中Bcl-2、Bax的敘述情況；HE染色察看其病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果

〔1〕C組AST、ALT、LDH明顯低于B組〔PPP>0.05〕?！?〕A組無明顯病理形態(tài)改變，B組術(shù)后肝組織出現(xiàn)明顯的病理損害，C組病理變化明顯減輕。結(jié)論

TMP可能通過上調(diào)Bcl-2或Bcl-2/Bax敘述而減輕肝移植體的低溫保留再灌注損傷，對(duì)供肝有愛護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】

肝移植；保留再灌注損傷；川芎嗪；Bcl-2；Bax

Protectiveeffectoftetramethylpyrazineonlivergraftinratlivertransplantation

【Abstract】

Objective

Toinvestigatetheprotectiveeffectoftetramethylpyrazine(TMP)preconditioningonlivergraftinratlivertransplantation.Methods

PerformingtheoperationoflivertransplantationinmaleSprague-DawleyratsreferredtoDelriviereandKamadawithcuffanastomosingmethods，theratswererandomlydividedintothreegroups：Agroup(n=6，shamoperationgroup)，Bgroup(n=30×2，livertransplantationcontrolgroup)，Cgroup(n=30×2，TMPgroup).Theparametersofliverfunction(AST，ALTandLDH)weretestedbyauto-biochemicalanalyseringroupBandCafterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectivelyviatheplasmasamples；partofthelivertissuewassampledtodeterminetheexpressionofBcl-2andBax.TheparametersingroupAwereexamed3haftertheoperation.TheexpressionofBcl-2andBaxwasdeterminedbyimmunohistochemistytechniquewithpathologicalimaginganalyser.Also，partsoflivertissuesampleswereusedtodetectthehistopathologicchanges.Results

〔1〕ThelevelsofAST，ALTandLDHweresignificantlydecreasedingroupCcomparedwiththatingroupB〔P＜0.01〕afterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectively.〔2〕TheexpressionofBcl-2weresignificantlyincreasedingroupCcomparedwiththatingroupB〔P＜0.01〕afterreperfusion0.5h，3h，6hrespectively.ThedifferentexpressionofBaxbetweengroupCandgroupBwasnonsignificant.〔3〕ApproximatelynormallymorphologicstructurewasfoundingroupA，someobvioushistopathologicchangesingroupBcouldbeseenmorphologically.ButingroupC，somehistopathologicchangeswerealleviated.Conclusion

TMPcanimproveliverfunctionandalleviatehistopathologicdamageinlivertransplantationinratsduringpreservationandreperfusioninjuryprobablybyup-regulatingtheexpressionofBcl-2orBcl-2/Baxandexertaprotectiveeffectonlivergraft.

【Keywords】

livertransplantation；preservationandreperfusioninjury；tetramethylpyrazine；Bcl-2；Bax

肝移植是治療終末期肝病最有效的伎倆，肝移植體低溫保留再灌注損傷是肝移植術(shù)后肝原發(fā)性無功能〔PFN〕的重要原因，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。目前人們針對(duì)凋亡發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)，探索各種防治辦法，從而減輕肝移植體保留再灌注損傷成為了研究的熱點(diǎn)。川芎嗪〔tetramethylpyrazine，TMP，四甲基吡嗪〕是從中藥川芎中別離、純化的一種生物堿，TMP具有抑制血小板的匯集、改善微循環(huán)、愛護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、反抗氧自由基的氧化作用以及鈣拮抗作用；TMP作為鈣拮抗劑，可能通過激活腺苷酸環(huán)化酶及抑制鈣離子內(nèi)流作用而抑制細(xì)胞凋亡［1］；TMP還可以影響c-fos敘述而抑制細(xì)胞凋亡［2］。但目前TMP在細(xì)胞內(nèi)的分子機(jī)制研究甚少，需進(jìn)一步研究。TMP是否影響移植肝保留再灌注損傷細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的敘述，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠肝移植模型，察看TMP對(duì)保留再灌注損傷中肝組織Bcl-2、Bax敘述的影響，探討TMP對(duì)大鼠移植肝的愛護(hù)作用。

1

材料與辦法

1.1

材料

封閉群雄性SD大鼠126只，供體體重200～250g，受體體重340～380g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SSW-3X顯微外科手術(shù)器械包〔上海醫(yī)療器械有限公司〕。Q550CW自動(dòng)病理圖像分析儀〔德國LEICA公司〕。TMP〔40mg/2ml/支，北京第四制藥廠〕。Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒、AST、ALT、LDH試劑盒〔北京中山生物技術(shù)有限公司〕。

1.2

實(shí)驗(yàn)分組及處理

封閉群SD大鼠〔n=126〕隨機(jī)分為3個(gè)組：A組〔n=6，假手術(shù)組〕、B組〔n=30×2，肝移植對(duì)照組〕、C組〔n=30×2，TMP干涉組〕；B、C組再根據(jù)再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h不同時(shí)相，又分為5個(gè)亞組。

1.3

制備大鼠肝移植模型

參照Delriviere和Kamada等［3］辦法建立大鼠肝移植模型。安體醚吸入麻醉，供體肝上上腔靜脈結(jié)扎，供體肝下上腔靜脈與受體右腎靜脈按照Delriviere等［4］辦法行袖套吻合〔套管內(nèi)徑為2.0~2.2mm、外徑為2.8~3.0mm〕；供肝門靜脈與受體門靜脈行袖套吻合〔套管內(nèi)徑為1.5~1.8mm、外徑為2.0~2.2mm〕；結(jié)扎受體肝固有動(dòng)脈；最后將供肝膽管與受體膽管采用套管法重建〔內(nèi)徑為0.65mm、外徑0.96mm硬膜外導(dǎo)管〕。B組：灌洗及保留液為4℃冷平衡鹽溶液〔含肝素鈉5u/ml〕；C組：灌洗及保留液為冷平衡鹽溶液中加TMP〔320g/L〕；A組：開腹后游離肝周韌帶，別離膽總管及門靜脈，關(guān)腹。

1.4

標(biāo)本的采集和檢測

B、C組察看術(shù)后的一般情況，并分別于肝移植再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h取腹主動(dòng)脈血待測肝功能〔AST、ALT、LDH〕，同時(shí)取移植肝一小塊肝組織待制石蠟標(biāo)本；A組于關(guān)腹后3h取標(biāo)本作為正常對(duì)照。采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行肝功能測定；利用免疫組織化學(xué)染色的辦法結(jié)合病理圖像分析測定各切片中細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax敘述情況。取局部切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，光鏡下察看肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5

免疫組化染色辦法

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性；微波修復(fù)抗原，加封閉用羊血清，37℃孵育15min；加1∶50Bcl-2或1∶50Bax抗體工作液，4℃孵育過夜；滴加生物素的羊抗兔IgM〔1∶100〕，37℃孵育30min；每張切片滴加50μlSP復(fù)合物，于37℃孵育30min；以新鮮配制的DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡下察看。鏡下可見陽性染色主要位于胞漿內(nèi)，少數(shù)為核膜，呈淺黃、棕黃或棕褐色顆粒。每張切片內(nèi)中外隨機(jī)選取6個(gè)視野，運(yùn)用病理圖像分析儀顯微鏡下察看并測定陽性細(xì)胞的輝度值〔與Bcl-2、Bax敘述成反比〕。

1.6

統(tǒng)計(jì)學(xué)辦法

所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±規(guī)范差〔x±s〕表示，在計(jì)算機(jī)上用SPSS11.0軟件包處理，方差齊性分析后，組間比擬用均數(shù)t檢驗(yàn)，組內(nèi)比擬用單因素方差分析，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)間兩兩比擬采用q檢驗(yàn)，指標(biāo)間相關(guān)分析用直線相關(guān)分析，P＜0.05為差別有顯著性。

2

結(jié)果

2.1

一般情況

本實(shí)驗(yàn)肝移植60例，供體手術(shù)時(shí)間、血管袖套準(zhǔn)備時(shí)間、受體手術(shù)時(shí)間、無肝期分別為〔29.65±3.18〕min、〔9.05±2.12〕min、〔42.64±4.07〕min、〔5.18±1.23〕min。手術(shù)成功率為88.33%〔53/60〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝移植TMP干涉組較肝移植對(duì)照組在供肝恢復(fù)血流后，其外表很快呈鮮紅色，無花斑狀表現(xiàn)，門靜脈不擴(kuò)張，肝臟無腫脹，腸管無淤血，腸系膜動(dòng)脈搏動(dòng)有力，膽汁源源不斷流出，上述表現(xiàn)明顯優(yōu)于肝移植對(duì)照組。

2.2

肝組織形態(tài)學(xué)變化

假手術(shù)組〔A組〕無明顯形態(tài)學(xué)改變；肝移植對(duì)照組〔B組〕術(shù)后肝組織隨著再灌注時(shí)間的延長，病理變化逐漸加重：肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞濁腫，變性呈顆粒狀，肝竇變窄，中性粒細(xì)胞附壁，繼而出現(xiàn)細(xì)胞核染色加深及局部核濃縮，局部還出現(xiàn)點(diǎn)狀或小片狀壞死，以術(shù)后6h最嚴(yán)重，6h后，病理變化隨著再灌注時(shí)間的延長逐漸減輕；肝移植TMP干涉組〔C組〕病理變化較B組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)明顯減輕：輕度的組織水腫，肝竇內(nèi)皮滲出較少，小葉結(jié)構(gòu)根本完好，炎癥細(xì)胞浸潤較少〔見圖1～2〕。

圖1

B組再灌注后6h肝組織HE染色〔×100〕

圖2

C組再灌注后6h肝組織HE染色〔×100〕《

2.3

大鼠各組AST、ALT、LDH含量

與A組比擬，B、C組各時(shí)點(diǎn)AST、ALT、LDH含量均顯著性增加〔P＜0.01〕；與B組相應(yīng)的時(shí)點(diǎn)比擬，C組各時(shí)點(diǎn)AST、ALT、LDH含量顯著性降低〔P＜0.01〕；B、C組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)間AST、ALT、LDH含量單因素方差分析差別顯著〔P＜0.01〕，且每兩個(gè)時(shí)點(diǎn)間q檢驗(yàn)有顯著性時(shí)效關(guān)系〔P＜0.05〕，見表1。

[1]

[2]

下一頁

表1

再灌注不同時(shí)點(diǎn)AST、ALT、LDH含量的變化

〔u/L，x±s〕

注：A組AST、ALT、LDH含量分別為〔82.78±5.60〕u/L、〔48.80±4.30〕u/L、(564.83±30.66)u/L；與A組比擬，△P＜0.01；與B組比擬，#P＜0.01

2.4

各組Bcl-2、Bax敘述輝度值變化

與A組比擬，B、C組于肝移植缺血再灌注后0.5h、3h、6hBcl-2敘述顯著性增加〔P＜0.01〕，Bax敘述顯著性降低〔P＜0.01〕；與B組比擬，C組0.5h、3h、6hBcl-2敘述顯著性上調(diào)〔P＜0.01〕，Bax敘述差別無顯著性；并且B、C組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)Bcl-2、Bax敘述差別有非常顯著性〔P＜0.01〕，且每兩個(gè)時(shí)點(diǎn)間q檢驗(yàn)有顯著性時(shí)效關(guān)系〔24h與48h間例外〕〔見表2、圖3～6〕。

圖3

B組再灌注后6h肝組織Bcl-2敘述〔×100〕《

圖4

C組再灌注后6h肝組織Bcl-2敘述〔×100〕《

圖5

B組再灌注后6h肝組織Bax敘述〔×100〕

圖6

C組再灌注后6h肝組織Bax敘述〔×100〕《

表2

各組Bcl-2、Bax敘述的輝度值變化

〔/um2，x±s〕

注：A組Bcl-2、Bax陰性對(duì)照值均為〔153.09±1.61〕/μm2；△與A組各時(shí)點(diǎn)Bcl-2值比擬，P＜0.01，Bax值P＜0.01；#與B組各時(shí)點(diǎn)Bcl-2值比擬，P＜0.01，Bax值P＞0.05

2.5

肝功能〔AST、ALT、LDH〕水平與Bcl-2、Bax敘述的相關(guān)性

AST、ALT、LDH水平與Bcl-2的敘述呈顯著性負(fù)相關(guān)，r值分別為-0.39〔P＜0.05〕、-0.51〔P＜0.01〕、-0.52〔P＜0.01〕；AST、ALT、LDH水平與Bax的敘述呈顯著性正相關(guān)，r值分別為0.71、0.54、0.75，P＜0.01；AST、ALT、LDH水平與Bcl-2/Bax敘述呈顯著性負(fù)相關(guān)，r值分別為-0.73、-0.72、-0.86，P＜0.01。

3

討論

肝移植術(shù)后肝原發(fā)性無功能是肝移植后死亡的主要原因，與肝移植低溫保留再灌注損傷密切相關(guān)［5］，其中細(xì)胞凋亡在組織細(xì)胞的喪失和器官功能衰竭方面發(fā)揮著重要作用［6，7］。肝移植體從可逆到不可逆的轉(zhuǎn)變反映了肝細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞凋亡的精細(xì)平衡，基因調(diào)控是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控機(jī)制［8］。

Bcl-2基因家族是最受關(guān)注的基因之一，任何一個(gè)死亡啟動(dòng)子與Bcl-2或Bcl-XL形成異型二聚體時(shí)，細(xì)胞就可以防止發(fā)生凋亡［9］。Bcl-2蛋白是一種膜整合蛋白，主要分布在線粒體內(nèi)膜細(xì)胞膜內(nèi)外表、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜等處，具有抑制凋亡的作用［10］。目前認(rèn)為其抗凋亡的主要機(jī)制是：抑制細(xì)胞內(nèi)織網(wǎng)鈣庫釋放鈣，維持細(xì)胞內(nèi)鈣的穩(wěn)定；恢復(fù)線粒體膜電位和調(diào)制線粒體內(nèi)外膜之間通透性轉(zhuǎn)變孔〔PTP〕，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C、凋亡蛋白激活因子〔APAF-1〕、凋亡誘導(dǎo)因子〔AIF〕等［11，12］；抑制Caspase如Caspase-9的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)放大反饋［13，14］；直接抗氧化，反抗氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡［15］；抑制凋亡蛋白Bax及Bak的細(xì)胞毒作用等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示移植肝對(duì)照組再灌注0.5h即出現(xiàn)Bcl-2敘述增加，與假手術(shù)組比擬差別有非常顯著性〔P【參考文獻(xiàn)】

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