精品學習資料精品學習資料精品學習資料【免疫學檢驗】知識點整理（第一部分）概論+抗原抗體反應1免疫學基本概念及其生物學功能；免疫：機體識別和排斥抗原性異物的一種生理功能免疫三大功能：免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視中樞免疫器官（骨髓和胸腺）外周免疫器官（淋巴結、脾臟、扁桃體）免疫細胞：淋巴細胞（T，B，NK）、單核巨噬細胞、其他免疫應答細胞（中性粒、嗜酸性、嗜堿性和肥大細胞）免疫分子：免疫球蛋白（IgM，IgG，IgA，IgE，IgD），補體，細胞因子，細胞黏附分子，人類白細胞分化抗原免疫應答：機體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生的一系列反應， 并以排出或分解該抗原為目的的反應過程。過程：抗原的識別、處理、信息傳遞（識別階段），免疫細胞的激活、增殖、分化（活化階段）以及產生一系列的免疫效應因子（效應階段）。臨床免疫學檢驗：研究免疫學檢測理論、技術、應用，免疫疾病發(fā)病機制、免疫診斷、及防治的一門醫(yī)學領域的應用學科。免疫學檢測技術的基礎是抗原抗體反應，免疫學技術有凝集反應、沉淀反應、補體參與的反應、中和反應和標記免疫反應五種類型。免疫檢驗：1）利用免疫檢測原理和技術檢測免疫活性細胞、抗原、抗體、補體、細胞因子、細胞黏附分子等免疫相關物質； 2）體液中的微量物質如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素。臨床免疫學：利用免疫學理論和技術研究疾病的免疫病理機制、診斷和鑒別診斷、療效評價、預后判斷和預防的多個分支學科的總稱。免疫性疾病：各種原因引起的機體免疫應答異常所致的疾病， 包括超敏反應性疾病、自身免疫病、免疫缺陷病和免疫增生病。感染免疫學：研究病原微生物與宿主相互關系從而控制感染的學科， 傳統(tǒng)免疫學核心。腫瘤免疫學：研究腫瘤免疫原性、機體抗腫瘤的免疫效應及機體的免疫功能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相互關系以及腫瘤免疫診斷與防治的學科。歡迎下載第1頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料移植免疫學：研究移植物與宿主相互關系從而選擇移植物和延長移植物存活的學科。2血清學反應的概念；抗體主要存在于血清中，體外的抗原抗體反應稱為血清學反應?？乖贵w反應：抗原與相應抗體在體內或體外發(fā)生的特異性結合反應，特異性取決于抗原表位和抗體超變區(qū)分子間的結構互補性與親和性，并通過靜電引力、范德華引力、氫鍵結合力和疏水作用力等非共價鍵結合在一起。3抗原抗體的反應原理Ag決定簇和Ab分子超變區(qū)分子間的結構互補性；分子表面特異的可逆的弱結合力；親水膠體轉化為疏水膠體*親和力（affinity）是抗體分子上一個抗原結合點與對應抗原表位之間相互適應而存在的引力。這是抗原與抗體之間固有的結合力。*親合力（avidity） 是指反應系統(tǒng)中整個抗原分子與相應抗體之間的結合能力。親和力與親和性、抗體的結合價和抗原的抗原決定簇數目相關。 親和力越大，抗原抗體結合越牢固。K=抗原抗體復合物濃度/（游離抗原濃度*游離抗體濃度）K值大的抗體與抗原牢固結合，不易解離，說明該抗體有高親和力。親水膠體轉化為疏水膠體：血清學反應條件下，抗原抗體均帶負電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體。當抗原與抗體結合后，表面電荷減少，水化層變薄，失去親水性能，抗原抗體復合物成為疏水膠體。電解質作用下，中和膠體表面電荷，使疏水膠體靠攏，形成可見的抗原抗體復合物。4抗原抗體反應的特點。特異性：抗原與抗體結合反應的專一性。分子基礎 ：抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構型的互補性交叉反應：兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結構的抗原表位， 可與彼此相應的抗血清發(fā)生反應可逆性：解離后抗原抗體仍保持原有理化性質和生物活性。歡迎下載第2頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料影響因素：抗體與抗原間的親合力，親合力越高，結合越牢固，越不易解離；環(huán)境因素一pH、離子強度比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應需遵循一定的量比關系。前帶 （prezone）：抗體過量。后帶（postzone）:抗原過量。等價帶（equivalencezone）：抗原抗體比例合適階段性：親水膠體轉疏水膠體的化學和物理變化過程： 抗原抗體特異性結合（幾秒至幾分鐘，不出現可見反應），非特異性促凝集（抗原 -抗體復合物在適合溫度pH電解質等環(huán)境因素影響下，進一步交聯和聚集，出現肉眼可見沉淀、凝集、細胞溶解等反應，數分鐘至數小時）【熟悉免疫學發(fā)展簡史；抗原及免疫球蛋白的定義及功能5抗原抗體的反應影響因素。反應物自身因素：*抗原：1.理化特性2.Ag決定簇數量3.Ag決定簇種類*抗體：1.來源2.特異性與親和力3.濃度環(huán)境條件：*電解質：0.85%NaCl*使［Ag-Ab］表面的電勢下降，失去電荷，破壞水化層，形成凝集或沉淀。濃度過高出現鹽析。酸堿度：pH6?9*酸凝集：當pH為3左右時，接近細菌Ag的等電點，可出現非特異性凝集。蛋白質具有兩性電離性質，每種都有固定的等電點。反應液中 pH過高或過低都可影響抗原或抗體的理化性質。溫度：15?40℃,冷凝集為4℃。在一定范圍內，溫度增高，分子運動加快，反應速度加快，但結合不牢固，易解離；溫度低，反應速度慢，但結合牢固。6抗原抗體反應的類型。沉淀反應；凝集反應；補體參與的反應；中和反應；免疫標記2免疫原和抗體的制備（免疫原和抗血清的制備；單克隆抗體與基因工程）歡迎下載第3頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料1免疫原是誘導機體產生抗體并能與抗體發(fā)生反應的物質。半抗原是指僅有抗原性而無免疫原性的物質，與載體結合后可具有免疫原性。2特異性IgG抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析法、親和層析法等；制備單價特異性抗血清可采用親和層析法和吸附劑方法。1可溶性免疫原制備：粗提——組織勻漿制備，細胞的破碎2可溶性免疫原提純：超速離心法，選擇性沉淀法，凝膠層析法，離子交換層析法，親和層析法，電泳法1多克隆抗體的概念由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產生的抗體，是多種抗體的混合物?？寡迨墙涍^抗原免疫的動物血清。在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內多個B細胞克隆被激活并產生針對多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。2多克隆抗體的制備流程；免疫原（及佐劑）的制備；免疫動物（動物選擇和動物免疫）；試血；采血收集血清；抗血清的鑒定；抗血清的純化；抗血清的保存3免疫佐劑的概念、常見種類及作用機制。免疫佐劑是先于抗原或與抗原一起注入機體，可增強機體對該抗原的特異性免疫應答或改變免疫應答類型的物質。氫氧化鋁，明帆，弗氏佐劑（Freundadjuvant） ，脂質體，細胞因子（乳化方式：研磨法：易乳化，但抗原或佐劑用量大。攪拌混合法：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑，但不易乳化完全）作用機制：1.改變抗原的物理性狀，使抗原在體內滯留或延緩釋放，延長抗原與免疫細胞作用的時間，從而增強抗原免疫原性。 2.抗原在佐劑的輔助作用下，更易被巨噬細胞有效吞噬和有效的加工處理和呈遞。 3,刺激單核一巨噬細胞活化，釋放細胞因子調節(jié)和增強淋巴細胞的應答能力。 4,刺激淋巴細胞增生分化，從而增強和擴大免疫應答能力。歡迎下載第4頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料應用佐劑的缺點：佐劑?；煊形⒘科渌镔|，這些物質進入體內后也可引起抗體的產主，影響抗血清的特異性；注射佐劑可引起局部形成肉芽腫和無菌性膿腫；反復注射，易發(fā)生超敏反應，使局部組織壞死，甚至引起動物死亡。4免疫血清制備動物的選擇1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好； 2.動物個體選擇：適齡、健壯、無感染正常動物、體重合乎要求； 3.抗原性質：酶類一豚鼠；甾體激素一家兔4.血清用途：R型:等價帶寬，適于診斷試劑.用家兔免疫產生.H型:等價帶窄，適于免疫治療.用馬免疫產生.5.抗血清需要量選擇免疫方法1.免疫劑量：1）不能過大或過小，否則產生免疫耐受；2）首次免疫劑量不宜過大3）大:0.5-1mg/只/h：0.1-0.6mg/ 只免疫途徑:1）皮內或皮下注射：a,采用多點注射（8-10點）；b.半抗原宜皮內多點注射； c.皮內注射易引起細胞反應，對提高抗體效價有利，但皮內注射較困難（因佐劑加入后粘度大）。2）腹腔和靜脈注射：多用于顆粒性抗原和加強免疫。3）淋巴結內注射： 適宜于微量抗原（先用完全佐劑在足掌作基礎免疫）。免疫時間：1）間隔約10-20天（宜長、否則導致免疫耐受）；2）二次以后每次間隔7~10天（過長一刺激變弱一抗體效價不高。）3）一般接種5-8次，不超過2個月；4）半抗原的免疫間隔要求較長（30~40天）。如8次免疫后仍不產生抗體，則應更換動物。采血及試血頸動脈采血法：家兔、綿羊、山羊；心臟采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、雞；靜脈采血法：家兔、山羊、綿羊免疫血清的純化：免疫血清是成分復雜的混合物，除有特異性和非特異性抗體，還有各種蛋白成分抗血清一硫酸銨鹽析多次（粗提）一徐和層析，離子交換層析，凝膠過濾一4gG類抗體（不純）一凍和層析，吸附法一噴異性IgG抗體歡迎下載第5頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料抗體的鑒定：1.效價的鑒定：抗體含量測定。 根據抗原性質不同，顆粒性抗原可采用凝集試驗?？扇苄钥乖Ｓ妹庖唠p擴散法 2抗體的純度鑒定：SDS。若只出現一條蛋白電泳區(qū)帶說明抗體純化已達到要求，而出現多條蛋白區(qū)帶則表明抗血清中混有雜蛋白，必須進一步純化。 3.特異性鑒定：抗體對相應或相似抗原識別能力一般用特異性抗原及其相似的抗原與待鑒定抗體進行免疫雙擴散試驗。如果出現交叉反應，說明有雜抗體存在?？蓱孟鄳乖针s抗體，即可得到單價特異性抗體。 4抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好：親和力測定主要有平衡透析法、酶聯免疫法和放射分析法。親和力的高低是由抗原分子和抗體分子的結合位點、抗原決定簇之間立體構型的合適度決定的。免疫血清的保存：1.4。。保存：可保存3?6個月2.低溫保存：-20?-40℃,可保存2?3年?？贵w的保存濃度為20?30mg/ml為宜，加入1/10000的硫柳汞或1/1000的疊氮鈉防腐，并加入等體積的中性甘油，分裝小瓶，置 -20℃以下低溫保存。3.冰凍干燥保存：可保存5?10年4單克隆抗體的概念每一克隆B細胞所產生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應的抗體。5淋巴雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術：在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏 B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為 B細胞雜交瘤。6單克隆抗體的制備流程1、親本細胞的選擇（骨髓瘤細胞： BALB/C小鼠骨髓瘤NS-1細胞株和SP2/0細胞株，致敏B細胞：免疫脾細胞，每次抗原用量100ug）2、細胞融合（細胞融合劑——EG種類：分子量1000>1500>4000的PEG是最常用的細胞融合劑；作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合；歡迎下載第6頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG,其純度與毒性有所不同。）3、雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)基，篩選與克隆化3凝集反應1凝集反應的原理及特點；定義：細菌和紅細胞等顆粒性抗原或表面包被抗原的顆粒性載體與相應抗體結合后，可出現肉眼可見的凝集現象。概念：顆粒性抗原+相應抗體I適量電解質）凝集現象，可溶性抗原（或抗體）+載體顆粒I致敏顆粒+相應抗體（或抗原）I適量電解質）凝集現象特點：1.抗原為顆粒性抗原或可溶性抗原致敏顆粒； 2.反應時間較短，需幾到十幾分鐘；3.反應產物為凝集塊；4.凝集反應抗原分子大，反應面積小，為使抗體分子不致過多，試驗時需稀釋抗體 。2常見的直接凝集反應；直接凝集試驗：顆粒性抗原在有電解質的參與下，直接與相應抗體結合出現的凝集現象。凝集原（agglutinogen）:凝集反應中的抗原凝集素（agglutinin）:凝集參與反應的抗體分類：玻片凝集實驗（將已知抗體與待測顆?？乖苯拥蛢r在玻片上，混勻并在室溫下反應數分鐘，用肉眼或低倍鏡觀察有無凝集現象，出現顆粒凝集的為陽性反應。方法評價：簡便、快速；定性檢測方法； 但敏感性較低。臨床應用：主要用于菌種鑒定和血清學分型，也可檢測病人血清中有無相應的抗體；用于人類ABO血型鑒定。），試管凝集實驗（顆粒性抗原（如細菌或紅細胞等）與相應抗體在試管中直接結合，在一定條件下，出現肉眼可見的凝集現象。方法評價：經典的半定量試驗；敏感性不高；干擾因素多，影響特異性；操作較簡單。臨床應用：用已知抗原測定血清中有無相應抗體及其含量，輔助臨床診斷疾病或流行病學調查。如外斐試驗、肥達試驗、交叉配血試驗。）3間接凝集反應的分類及常見試驗。歡迎下載第7頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料間接凝集試驗：將可溶性抗原(或抗體)吸附或偶聯于載體上，使之成為致敏載體顆粒，再與相應抗體(或抗原)作用，在適宜電解質的參與下，出現的凝集現象。載體(carrier) :試驗體系中與免疫無關的顆粒。致敏：抗原(或抗體)偶聯于顆粒表面的過程。致敏顆粒(sensitizedparticle): 吸附有已知抗原或抗體的顆粒。(正向間接凝集反應：用抗原致敏載體，檢測標本中有無相應抗體。先將可溶性抗原結合與載體顆粒，然后與待測標本中的抗體反應，出現肉眼可見凝集顆粒或塊。反向簡潔凝集反應：用特異性抗體致敏載體，檢測標本中有無相應抗原。簡潔凝集抑制反應：用抗原致敏載體，聯合相應抗體檢測標本中是否存在于致敏抗原相同的抗原。協同凝集反應：金黃色葡萄球菌的細胞壁中含有 A蛋白(staphylococcusproteinA,SPA)，SPA具有與IgG的Fc段結合的特性，利用該特性與IgG抗體相連制成抗體致敏的顆粒載體，當它與相應抗原反應時出現的凝集現象即叫協同凝集試驗。類風濕因子檢測： 原理：：類風濕因子(rheumatoidfactorRF)是由于細菌、病毒等感染因子，引起體內產生的以變性IgG(一種抗體)為抗原的一種自身抗體。IgM型為主要類型.IgG吸附于聚苯乙烯膠乳顆粒上作為檢測試劑， 在反應介質中，待檢血清中如含有RF，可與膠乳顆粒出現凝集反應。操作步驟:：在3塊載玻片上分別加一滴RF陽性血清、RF陰性血清及待檢血清；加一滴IgG致敏的膠乳于各血清樣品中，輕微晃動載玻片混勻.；1min后觀察凝集反應發(fā)生情況.注意事項：器材要潔凈、血清要新鮮、以確保結果可靠.；注意陰性、陽性對照的設立.；注意血清及致敏膠乳加樣量的比例.)歡迎下載第8頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料紅細胞為載體：間接血凝試驗（可溶性抗原吸附于人 O型紅細胞或綿羊、家兔紅細胞上，制備成抗原致敏的紅細胞，然后與相應抗體作用，在有電解質存在的條件下，作用一定時間后可出現肉眼可見的紅細胞凝集現象。 方法評價：敏感性高于直接凝集試驗和膠乳凝集試驗；操作簡便易行、快速、成本低廉。）聚苯乙烯膠乳微粒為載體：膠乳凝集試驗間接凝集反應特點：敏感、快速、操作簡便、不需特殊儀器；檢測范圍廣 （各種抗體和可溶性抗原）。敏感性比直接凝集反應高。間接凝集反應應用：抗原的檢測：抗體的檢測：感染性疾病、自身免疫性疾病、變態(tài)反應性疾病。4抗球蛋白試驗原理及應用；利用抗球蛋白抗體作為第二抗體起橋聯作用，鏈接與紅細胞表面抗原結合的特異抗體，使紅細胞凝集，用于檢測抗紅細胞不完全抗體。直接Coombs試驗：新生兒溶血癥，自身免疫性溶血癥，特發(fā)性自身免疫性貧血（患者紅細胞上不完全抗體）間接Coombs試驗：檢測母體Rh（D）抗體，紅細胞不相容輸血后產生的血型抗體測定（血清中游離的不完全抗體）由于不完全抗體只能與一個RBC的決定簇結合，而不能同時與兩個RBC的決定簇結合，而抗球蛋白抗體作為第二抗體可達到連接與 RBC表面抗原結合的特異性抗體，使RBC凝集。針對于不完全抗體（IgG抗體）的檢測。4沉淀反應0沉淀反應沉淀反應是指可溶性抗原與相應抗體在適當條件下發(fā)生特異性結合而出的沉淀現象.根據沉淀反應介質和檢測方法的不同，將其分為液體內沉淀試驗、凝膠內沉淀試驗和凝膠免疫電泳試驗三大基本類型。歡迎下載第9頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料免疫濁法度測定為液體內沉淀試驗；單向擴散試驗平板法是一種定量的凝膠內沉淀試驗，免疫電泳技術是電泳分析與沉淀反應的結合產物， 常見的有對流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳等。【鉤狀效應：由抗原過量引起，導致形成的免疫復合物分子小，發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少的現象?！竞５卤で€：抗體過量反應體系中，抗體過量時，免疫復合物形成隨著抗原遞增至抗原抗體比例最適合處達到最高峰，沉淀反應明顯，而當抗原過量時，形成的免疫復合物逐漸減少，呈現一個拋物線形曲線。1（凝膠內沉淀實驗）單向免疫擴散實驗原理和應用 Mancini曲線和Fahey曲線原理：將一定量的抗體混于瓊脂凝膠中，使待測抗原溶液在瓊脂內由局部向周圍自由擴散，在二者濃度比例合適處一定區(qū)域內形成可見的白色沉淀環(huán)。 環(huán)的大小與抗原濃度成正相關。Mancini曲線：大分子抗原（IgM）和長時間擴散（＞48）的結果處理。K=C（抗原濃度）/d的平方（沉淀環(huán)直徑）Fahey曲線：小分子抗原和擴散時間較短（24h）的結果處理。K=logC/d應用：原用于定量測定IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉帖蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等血漿蛋白。2雙向免疫擴散實驗應用將抗原和抗體溶液分別放在凝膠的對應孔中， 讓兩者在凝膠中自由擴散，當抗原與抗體相遇在濃度比例適當處形成可見的白色沉淀線。應用：1）血清學診斷2）免疫化學分析：沉淀線位置主要與抗原、抗體兩者濃度比例有關，沉淀線靠近抗原空，提示抗體含量高；靠近抗體空，提示抗原含量多。分子量大擴散慢，擴散圈小，形成的沉淀線彎向分子量大的一邊。如二者分子量相對，則形成直線。3）抗體效價滴定：固定抗原濃度，稀釋抗體；或抗原抗體雙方做不同稀釋，經自由擴散，一出現沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。4）分析抗原性質5）鑒定抗原或抗體純度：多條沉淀線不純3定向免疫擴散原理（對流免疫電泳，火箭免疫電泳）定向免疫擴散：在電場作用下，抗原或抗體或二者在凝膠介質中定向移動發(fā)生的沉淀反應。歡迎下載第10頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料對流免疫電泳：將雙向免疫擴散與電泳結合在直流電場中的定向加速的免疫擴散技術，常用語抗原或抗體定性分析、效價測定和純度鑒定。在pH8.6的巴比妥緩沖液制備瓊脂凝膠板，抗體因等電點高、帶微弱的負電荷，且分子量較大，因此在電場中的電泳力小于電滲力，泳向負極；而一般抗原蛋白帶較強的負電荷，且分子量較小，電泳力大于電滲力，泳向正極。電泳時，抗原孔放于靠近負極一側，抗體孔放于靠近正極的一側，抗原抗體相對泳動，在兩孔間相遇，比例合適時可形成肉眼可見的沉淀線?；鸺庖唠娪荆涸诳乖妶鲎饔孟拢谀z中定向移動、加速發(fā)生的單相免疫擴散。用于IgA、IgG、IgM和sIgA，不同成分C3、C4以及裂解產物AFP等血漿蛋白檢測、在瓊脂糖凝膠板一端打孔、定量加樣后，樣品孔至于電泳槽負極端?？乖陔妶鲎饔孟?，并與凝膠中的抗體反應，逐漸形成梯度濃度，使沉淀帶越來越窄，在抗原、抗體比例適當時形成火箭峰樣沉淀，峰高低與抗原量呈正相關。4定向-自由聯合免疫擴散（免疫電泳原理和應用）免疫電泳：先將蛋白質抗原在凝膠中做區(qū)帶電泳，根據其所帶電荷、分子量和構型不同分成不可見的若干區(qū)帶，然后沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應抗血清，進行雙向擴散，兩者比例適合處形成弧形沉淀線。用于分析純化后的抗原或抗體成分分析，粗略分析其純度；正常及異常體液中免疫球蛋白的識別和鑒定：無丙種球蛋白血癥、冷球蛋白血癥、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝病等患者的血清蛋白成分的分析；多發(fā)性骨髓瘤血清 M蛋白的檢測和鑒定。免疫固定電泳：在血清蛋白區(qū)帶電泳后，將抗血清或浸透抗血清的乙酸纖維素或濾紙條放在區(qū)帶表面而不是旁側槽中，使抗體與對應抗原直接發(fā)生沉淀反應，使抗原被固定在電泳位置上，對樣品中所含成分及其性質進行分析鑒定，用于鑒定遷移率相近的蛋白和M蛋白。5免疫濁度分析技術（液相中沉淀反應）原理、方法和分類；影響因素（心血管病、血液病、腎功能、神經系統(tǒng)。免疫功能。營養(yǎng)狀態(tài)以及藥物濃度的檢測和分析）原理：可溶性抗原與相應抗體特異結合，兩者比例適合和增濁劑作用下，課快速形成一定大小的免疫復合物，使反應出現濁度。歡迎下載第11頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料免疫濁度分析影響因素（抗體的質量：特異性高、效價高、親和力強和使用 R型抗體，抗原抗體比例，反應的條件：pH6.5~8.5，，離子強度大，增濁劑，標本的因素）透射免疫比濁法：當一定波長（340nm）的光線通過抗原抗體反應混合液時，由于抗原-抗體復合物形成使入射光被反射、吸收或散射而減弱，入社光被吸收的兩與免疫復合物量呈正相關。【當抗體量保持過剩時，怎就抗原量導致免疫復合物增多、吸光度增強。加入增濁劑聚乙二醇（PEG）8000（消除蛋白質分子周圍的電子云和水化層，促進特異性抗原、抗體分子靠近并結合成大分子復合物 終點法縮短反應時間，速率法增加反應峰值）能加速免疫復合物形成。散射免疫比濁法：用激光照射液相中抗原-抗體符合物微粒時部分光線發(fā)生散射，通過測定免疫復合物引起的光的散射強度（復合物大小、形狀和輸了）來測定抗原含量?！井斂贵w保持過剩，反應也中加入PEG，增加抗原量會導致散射光快速加強?！窘K點散射比濁法：當抗原抗體相遇后免疫反應立即開始，達到平衡10~30min在復合物聚合產生絮狀沉淀之前。 速率散射比濁法：單位時間內抗原與抗體反應速度或免疫復合物形成的量；在抗體過量的情況下，隨著抗原量增加，反應速度越來越快，棉衣服和物量也迅速增加，出現峰值所需時間隨之縮短【25S】6抗原性質分析出現哪三種結果現象？結果解釋？形成的沉淀可出現：相吻、相交、相切三種現象解釋：互相吻合相連：抗體與兩種抗原中的相同表位結合形成沉淀， 但不能說明兩種抗原完全相同相交：兩種抗原完全不同相切：兩種抗原部分相同5放射免疫技術：【放射免疫技術：一放射性核素作為示蹤物的一種免疫技術。【放射性核素：自然條件下課發(fā)生自發(fā)性轉化，由一種核素轉變成另一種核素，并同時放出射線。歡迎下載第12頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料【放射性標記物：采用氯胺T方法將放射性核素鏈接在抗原或抗體分子上所形成的復合物【比放射活性：單位質量標記物所含的放射性強度，每分子抗原評價所結合的放射性園子數目【放射化學純度：在標記物中結合在抗原上的放射活性占該標記物總放射活性的百分比1放射免疫分析RIA的原理、評價原理：標記抗原和非標記抗原對限量特異性抗體的競爭結合反應。 *AgAb信號強度與待測抗原呈反比例關系。用PEG沉降免疫復合物，傾倒過剩*Ag，測定沉淀物放射強度，繪制標準曲線。評價：RIA敏感度高ug/L，與結構類似物質見的交叉反應少，特異性強，重復性好，批間批內誤差小，標本用量少。【放射性核素易衰變，放射性標記物不穩(wěn)定，試劑有效期短，核素易對環(huán)境和實驗室造成污染。2免疫放射分析IRMA原理、評價原理：以過量放射性標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結合反應。 固相抗原免疫吸附劑（【直接法檢測半抗原。 雙抗體夾心先用固相抗體與抗原反應，再與過量的標記抗體作用，形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物，反應平衡后洗滌除去游離的標記抗體，測定固相上的放射量【多價抗原）。 Ag-*Ab的放射性強度與待測抗原量呈正比關系評價：敏感性高，兩個表位不易產生交叉反應，特異性。穩(wěn)定性好，標記抗體和固相抗體均屬過量，不易受外界影響，加樣誤差不大。抗體用量偏多，抗體特異性純化較難。3相互比較，應用IRMA&RIA被標記物：抗體，抗原。標記物用量：過量，定量較小。反應速率：快，稍慢。反應方式：非競爭性結合，競爭。特異性：高，稍差?？乖瓩z測濃度范圍：寬，較窄。分離技術：PEG-雙抗體法，固相吸附法。應用范圍：小分子半抗原，大分子抗原或抗體。歡迎下載第13頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料RIA應用：技術優(yōu)勢（靈敏度高，特異性高，商品化實際，適合測定小分子半抗原）臨床應用（血清激素水平測定；病原體抗原或抗體測定，感染性疾病輔助診斷；血清腫瘤標志物測定，腫瘤輔助診斷和評價療效；藥物測定）6熒光免疫技術1熒光基本知識，熒光物質【熒光免疫技術：將抗原抗體反應的特異性與熒光物質檢測的敏感性和直觀性結合起來的一種免疫分析技術?！緹晒饪贵w染色技術：用熒光抗體對細胞、組織切片或其他標本中的抗原或抗體進行鑒定和定位檢測。（熒光免疫顯微技術：直接法、間接法、補體結合法和雙標記法。）免疫熒光測定術：時間分辨熒光免疫測定和熒光偏振免疫測定?！緹晒忖纾簾晒夥肿釉谀承├砘蛩刈饔孟拢瑹晒夥肿拥妮椛淠芰κ芗ぐl(fā)光較長時間的照射后會減弱的現象。【熒光素：能產生明顯熒光并能作為染料使用的有機化合物【Stokes位移：選擇熒光物質作為標記物時，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差?！緹晒馑赜绊懸蛩兀簆H（熒光光譜改變，強度降低）、溫度（20℃以上，熒光溫度猝滅）、熒光素濃度、雜質（溶劑中不發(fā)光物質：漠化物、碘化物、氨基苯）、細胞固定劑、化合物（苯胺、酚、硝基苯、鹵化物）【FITC:異硫氰酸熒光素，黃綠色熒光，易溶于水和乙醇。 RB200:四乙基羅丹明，不溶于水，溶于乙醇和丙醛，橘紅色。 TRITC四甲基異硫氰酸羅丹明，橙紅色，與FITC配合用于雙標記。PE：藻紅蛋白，紅色，流式熒光免疫技術中PE&FITC共用一個激發(fā)光?！捐|系稀土元素Eu3+螯合物激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，用于時間分辨熒光免疫測定。2熒光標記物制備熒光素標記抗體攪拌法：標記體積較大、蛋白含量較高的抗體。熒光素標記抗體純化：透析法和凝膠柱層析法去除游離的熒光素，DEAT-纖維素離子交換層析去除未標記及過度標記的抗體。歡迎下載第14頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料鑭系稀土元素標記物制備：元素離子不能直接與蛋白質結合，用有雙功能基團的螯合劑，將稀土元素與抗體或抗原分子的氨基偶聯。常用螯合劑：多竣基類、白塔-二酮體類、BCPDA標記方法：抗體和完全抗原直接標記，小分子半抗原先與大分子載體蛋白連接，再標記Eu3+3熒光免疫顯微技術原理，評價，標本制作原理：以熒光顯微鏡為檢測工具，用熒光素標記特異性抗體或抗抗體，檢測固定組織細胞上的抗原或血清中的抗體，常用于定性和定位檢查。標本制作：（組織切片、印片、涂片、單層培養(yǎng)細胞）（玻片：用無自發(fā)性熒光的優(yōu)質玻片，厚度在0.8至1.2mm；用無水乙醇和乙醚浸泡后使用）固定（作用：①防止標本從玻片上脫落；②除去防礙抗原一抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③固定的標本易于保存，原則：①不能損傷細胞內的抗原；②不能凝集蛋白質；③不能損傷細胞形態(tài)；④固定后應保持細胞膜的通透性，以允許抗體進入與抗原結合。，染色， 37℃30min，4℃過夜。評價：組織學中抗原或抗體的定位、定性檢查，高度特異性和形態(tài)直觀。熒光容易消退，難以制備永久性標本，非特異熒光干擾。4間接免疫熒光法檢測ANA原理和運用過程，判斷用熒光素標記抗體與標本中相應抗原反應，再用熒光素標記的第二抗體與抗原抗體復合物中的第一抗體結合，洗滌干燥后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，檢測未知抗原或抗體。用于檢測自身抗體，病原體檢測，免疫病理分析。5熒光免疫測定技術（時間分辨熒光免疫測定）時間分辨熒光免疫測定：以鑭系元素標記抗體或抗原，并用時間分辨測定技術相結合的新型非放射性微量分析技術。鑭系元素熒光壽命長，10三次方到六次方倍，用時間分辨熒光測定儀延緩測量時間，可排除標本中非特異熒光干擾，得到稀土元素螯合物發(fā)射的特異性熒光。光譜激發(fā)光與熒光的波長差別明顯，Eu3+被激發(fā)的熒光光帶窄，發(fā)射峰尖銳，可在極窄的波長范圍內測定。（時間延遲和波長分辨）歡迎下載第15頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料7酶免疫技術：1基本概念酶免疫技術：以酶為標記物，將酶催化底物的高效性和抗原抗體反應的特異性相結合的免疫技術。【一步法優(yōu)缺點：（簡化流程，縮短試驗時間）鉤狀效應：標本中待測抗原濃度過高，抗原較容易與酶標抗體結合，而未與固相抗體結合，，不能形成夾心復合物，最總測定結果低于實際含量。假陰性。2酶標記物制備（供氫體，波長）HRP：辣根過氧化物酶，由糖蛋白和亞鐵紅素結合而成。OPD：鄰苯二胺，黃色，最大吸收波492nmTMB：四甲基聯苯胺，酶作用后天藍色，加酸終止酶變黃色， 450nm。ALP：堿性磷酸酶；白塔-半乳糖昔酶：大腸埃希菌的四聚體蛋白，用于均相酶免疫測定。3ELISA酶聯免疫吸附法原理、評價（雙抗夾心法：兩步法、一步法優(yōu)缺點；間接法；競爭法；捕獲法）ELISA:把抗原或抗體結合到某種固相載體表面（免疫吸附），并將抗原或抗體與酶連接形成酶標記抗原或抗體（酶聯），測定時將待測抗原或抗體和酶（標記）抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體反應形成抗原抗體復合物，通過洗滌的方法將固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他成分分離， 結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量形成一定比例， 通過底物顯色的方式定性或定量檢測有色產物量即可確定樣品中待測物質的含量。①雙抗體夾心法：測定大分子抗原，含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。先將特異性抗體與固相載體結合，形成固相抗體；加入待測樣本并溫育，形成固相抗體抗原復合物，洗滌除去其他游離成分；然后加入酶標抗體溫育，形成（固相抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物），洗滌除去游離酶標記抗體；加底物，根據產物顯色程度進行抗原的定性或定量檢測。②間接法：檢測抗體最常用。酶標抗體IgG歡迎下載第16頁，共18頁

歡迎下載精品學習資料精品學習資料精品學習資料③競爭法：抗原和半抗原的定量檢測。先用特異性抗體寶寶固相載體，然后同時加入待測抗原和酶標記抗原，待測樣本中的抗原與酶標抗原競爭性的與固相載體上的特異性抗體結合，溫育一定時間后洗滌，加底物顯色，顯色深淺與標本含量呈負相關。④捕獲法：血清中特定抗體Ig類別測定，病原體急性感染診斷中的IgM型抗體檢測。首先將針對IgM的地兒抗體寶寶與固相載體形成固相抗體，加入待測標本后，標本中所有Ig