關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒O抗體第1頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六CompanyLogo摘要目的：檢測(cè)傷寒O抗體一般采用肥達(dá)實(shí)驗(yàn)（直接凝集實(shí)驗(yàn)），在臨床診斷中有重要的意義。能否建立一個(gè)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中抗傷寒“O”抗體的實(shí)驗(yàn)體系，提高臨床診斷效果是本實(shí)驗(yàn)要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。第2頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六原理：以傷寒O抗原免疫動(dòng)物，制備出抗傷寒O抗體，將后者純化，與酶連接制備成酶標(biāo)抗體，以傷寒O抗原包被酶標(biāo)板，以制備的傷寒酶標(biāo)抗體為競(jìng)爭(zhēng)抗體，可以構(gòu)成競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒抗體的酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)。摘要第3頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

摘要結(jié)果：成功建立了一個(gè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)傷寒O抗體的實(shí)驗(yàn)體系結(jié)論：酶聯(lián)免疫吸附法可以檢測(cè)血清中抗傷寒“O”抗體第4頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六CompanyLogo實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔（1.性格溫順，一般不咬人，但其爪銳利，掙扎時(shí)易抓傷操作人員2.與傷寒沙門菌種屬差異大，可保證產(chǎn)生抗體3.體重大，血量多，得到的血清可保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行）實(shí)驗(yàn)試劑：飽和硫酸銨溶液PBS透析液辣根過(guò)氧化物酶(HRP)NaIO4溶液2.5%乙二醇溶液硼氫化鈉溶液包被稀釋液酶標(biāo)抗體待測(cè)抗體稀釋液洗滌液底物液實(shí)驗(yàn)器材：兔籠透析膜離心機(jī)加樣器酶標(biāo)板第5頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六CompanyLogo實(shí)驗(yàn)步驟1234制備傷寒O抗體

純化抗體

酶與抗體的連接

ELISA競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)傷寒O抗體（預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)）第6頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六制備傷寒O抗體顆粒性抗原傷寒桿菌備注第一周第一天耳緣靜脈注射0.1ml之前取血0.7-1ml，分離血清，待用第二天耳緣靜脈注射0.2ml第三天耳緣靜脈注射0.2ml 第四天耳緣靜脈注射0.5ml 第二周加強(qiáng)免疫：皮下注射1.0ml（兩側(cè)各0.5ml）第三周耳中央動(dòng)脈采血，分離血清第7頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六純化抗體

1份血清（5ml）+1份生理鹽水+2份飽和硫酸銨

置試管中2000轉(zhuǎn)離心20min

棄上清

1.5~2mlNS溶解沉淀

透析24h

收集、標(biāo)記、冰凍5管緩緩搖動(dòng),室溫2h（1.5h）鹽析法第8頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶與抗體的連接實(shí)驗(yàn)原理：NaIO4是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分（與酶活性無(wú)關(guān)的部分）的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體，反應(yīng)式如下：實(shí)驗(yàn)方法：標(biāo)記過(guò)程：1.將HRP5mg溶于0.5mlPH5.6HAC-NaAc緩沖液中（老師做）。2.滴入NaIO40.25ml,此時(shí)酶的顏色由黃變綠。4℃作用30min。第9頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶與抗體的連接3.加入2.5%乙二醇溶液0.5ml（穩(wěn)定劑）終止反應(yīng)，室溫30min。

4.加入待標(biāo)Ab1.5~2.0ml,用pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)液的pH至9.0左右，4℃過(guò)夜。5.加入0.1ml硼氫化鈉，4℃2小時(shí)。6.pH7.4PBS液透析過(guò)夜，收集、標(biāo)記成酶標(biāo)記抗體和凍存第10頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體（一）.酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體預(yù)實(shí)驗(yàn)1.包被Ag：抗原（傷寒）用包被液稀釋，每孔加入100μl，置37℃作用4h或4℃作用24h。2.洗滌：棄去孔中液體，洗滌液洗滌3次，每次1min，于吸水紙上充分拍干。3.加入樣品：每孔加入酶標(biāo)Ab及Ab各100μl，放入37℃恒溫箱中孵育30min。（如圖1）4.洗滌：同上5.加入底物液：每孔加入底物液A1滴、B1滴，避光放置約5-15min，密切觀察。6.終止反應(yīng)第11頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體待測(cè)酶標(biāo)原液1：51：251：125陰性對(duì)照1：251：501：1001：200（圖1）選擇每一排陰陽(yáng)色差最明顯者為最佳工作濃度第12頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體稀釋方法：1.酶標(biāo)抗體1:25——1200ul(牛奶）+50ul（酶標(biāo)）=1250ul1:50——600ul(牛奶）+600=1200ul1:100——600ul(牛奶）+600=1200ul1:200——600ul(牛奶）+600=1200ul第13頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體2.待測(cè)抗體1:5——600ul(牛奶)+150ul(待測(cè))=750ul1:25——600ul(牛奶)+150ul=750ul1:125——600ul(牛奶)+150ul=750ul第14頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體（二）酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體正式實(shí)驗(yàn)選取預(yù)實(shí)驗(yàn)所選定的最佳工作濃度對(duì)酶標(biāo)抗體及待測(cè)抗體進(jìn)行稀釋，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的可行性。方法如下：1.包被2.洗滌3.加樣(如圖2)4.洗滌5.顯色6.判斷檢出率第15頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)傷寒O抗體自己的待測(cè)Ab100ul+酶標(biāo)Ab100ul別組的待測(cè)Ab100ul+酶標(biāo)Ab100ul稀釋液100ul+酶標(biāo)Ab100ul

陽(yáng)性對(duì)照

待測(cè)1待測(cè)2待測(cè)3待測(cè)4

陰性對(duì)照?qǐng)D(2)經(jīng)洗滌顯色后,根據(jù)顏色深淺判斷檢出率,若待測(cè)組顏色更接近于陽(yáng)性對(duì)照,則記為“+”，反之則記為“-”。第16頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六結(jié)果討論（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰陽(yáng)第17頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六結(jié)果討論

以酶標(biāo)抗體1：100稀釋和待測(cè)抗體原液為最佳工作濃度做正式實(shí)驗(yàn)，得到以下結(jié)果，待測(cè)1“+”,待測(cè)2“+”,待測(cè)3“+”,待測(cè)4“+”;4組待測(cè)抗體均被成功檢出，檢出率100%。第18頁(yè)，共21頁(yè)，2023年，2月20日，星期六結(jié)果討論

（二）實(shí)驗(yàn)討論傷寒，由傷寒桿菌引起，檢測(cè)傷寒O抗體在傷寒桿菌感染的診斷中具有重要意義，采用肥達(dá)實(shí)驗(yàn)可對(duì)抗體進(jìn)行半定量檢測(cè)。但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，隨著輕型和亞型病人的增多，傷寒桿菌變異株增多，或發(fā)病早期大量使用抗生素，抑制傷寒沙門菌或應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素等免疫抑制劑抑制抗體的形成，肥達(dá)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率有下降的趨勢(shì)，難以滿足臨床要求。ELISA法檢測(cè)傷寒桿菌抗原或抗體，靈敏度好