課2多聚酶式應(yīng)增DNA片課背多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction，PCR）是種體外迅速擴(kuò)增DNA片的技術(shù)，它能以極少量的DNA為板，在幾小時內(nèi)制出上百萬份的DNA拷貝這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題，被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物、基因克隆和DNA序測定等各方面。在本課題中，我們將了解PCR技的基本原理，并嘗試用技術(shù)增DNA片段?；ǎ㏄CR原理在用技術(shù)擴(kuò)增DNA時，DNA的制過程與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似，因此，要了解PCR原，首先要分析細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分與反應(yīng)條件。下表列出了復(fù)制所需要的基本條件，想一想，如何在體外設(shè)置一個類似的復(fù)環(huán)境。引物是一小段DNA或RNA。它能DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對。用于PCR的引物長度通常20~30個核苷酸。復(fù)的具體過程涉及到DNA雙鏈的方向你已經(jīng)知道的條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確地表示的方向，通常將的經(jīng)基-OH末端稱為端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端。聚合酶不能從頭開始合成DNA而只能從3端伸鏈因復(fù)需引物。當(dāng)引物與母鏈通過堿基互補(bǔ)。配對結(jié)合后聚酶就能從引物的3端始延伸鏈因此的合成方向總是從子鏈的端3端伸（圖）。

在的制過程中，雙鏈的解開是進(jìn)行復(fù)的前提如何在體外將雙螺旋打開呢？這個過程可以通過控制溫度來實(shí)現(xiàn)。在80~100℃的溫度范圍內(nèi)雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的鏈又會重新結(jié)合成雙鏈（圖）利了熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器（圖5-8。高溫雖然解決了如何打開雙的問題，但是，又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問題。在解決這個新問題之前，PCR還非一種實(shí)用的實(shí)驗(yàn)方法。到20世紀(jì)年，耐高溫的Taq合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用（專題課題2），解決了上述矛盾，大大增加了效率，使PCR技術(shù)趨向自動化，而最終成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的基本方法之一。綜合以上分析可以看出，應(yīng)需要在一定的緩沖溶液（參見專題題）中才能進(jìn)行，需提供：模，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚酶，同時通過控制溫度使復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。（）PCR的反過PCR一要?dú)v三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性、復(fù)性和延伸三步（圖5-9。在循環(huán)之前，常要進(jìn)行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板徹變性的概率。從第二輪循開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物I伸而成的單會與引物II結(jié)，進(jìn)行的伸，這樣，聚酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的序，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。

變性當(dāng)溫度上升到90℃以上時雙鏈解聚為單鏈。復(fù)性溫度下降到50℃左右，兩引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。延伸溫度上升到72℃左右，溶中的四種脫氧核首酸A，，C，）在DNA聚合酶的作用下，據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

2PCR反應(yīng)體系的配方210倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5μ的4種脫氧核苷酸的量混合液1L20μmol/L的引物I2.5μ20μmol/L的引物II2.5μH28~33μ1?5U/μ的TaqDNA聚合酶?2U模板DNA5?10μ總體積50μ注：模板DNA的用量在lpg~1mg之間。實(shí)操在PCR實(shí)中，通常要用到微量離心管，它是一種薄壁塑料管（圖），總?cè)莘e為0.5mL。具體操作時，用微量移液器（圖5-10），按照旁欄的配方在量離心管中依次加入各組分，再參照下表的設(shè)置設(shè)計好PCR儀循環(huán)程序就可以了。想一想，在反中，如何設(shè)置對照實(shí)驗(yàn)？做所需的實(shí)驗(yàn)材料可以直接從生物技術(shù)公司購買。如果有PCR儀可設(shè)置個溫水浴鍋，溫度分別為℃、℃72℃，然后按照上表的要求，在3個浴鍋中來回移PCR反的微量離心管即可。操提為避免源等素的污染驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。

*20所的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并-℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。*20在微量心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心放在離心機(jī)上，離心約，反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入儀進(jìn)反應(yīng)。結(jié)分與價在260nm的外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰（圖5-11）?？梢岳玫倪@一特點(diǎn)進(jìn)行含量的測定，具體方法如下。將樣品行稀釋：取2μLPCR反液，加入98μL蒸水。以蒸餾作為空白對照，在波長260nm，將紫外分光光度計（圖5-12）的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。加入步1中稀液100至比色杯中，測定260nm處光吸收值。根據(jù)下的公式計算含。含（）=50×（的數(shù)稀釋倍數(shù)通過上述方法，你能估算出片段的含量比擴(kuò)增前增加了多少倍嗎？*公式中50的含義：在標(biāo)準(zhǔn)厚度1cm比色杯中OD為1相當(dāng)于50μ的雙鏈DNA。課延完成本課題后，你也許會覺得PCR的理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡單?？焖佟⒏咝?、靈活和易于操作正是的出優(yōu)點(diǎn)。到目前為止，人們已從基本的PCR方法中衍生出許多多的新方法，許多科普雜志和專著致力于介紹這些新方法。請你查閱相關(guān)資料，了解這