ICS65.020.30B44中國實驗動物學(xué)會團體標(biāo)準T/CALAS90—2020實驗動物 小鼠肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)檢測方法Laboratoryanimal-Detectionofmousehepatitisvirusbyreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationassay2020-12-01 發(fā)布 2021-01-01 實施中國實驗動物學(xué)會 發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020給出的規(guī)則起草。本文件由中國實驗動物學(xué)會歸口。本文件由全國實驗動物標(biāo)準化技術(shù)委員會（SAC/TC281）技術(shù)審查。本文件由中國實驗動物學(xué)會實驗動物標(biāo)準化專業(yè)委員會提出并組織起草。本文件起草單位：上海實驗動物研究中心、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：周潔、陶凌云、于海波、陳洪巖、李昌文。鏈鏈鏈鏈實驗動物 小鼠肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等擴增（RT-LAMP）檢測方法范圍本文件規(guī)定了實驗動物小鼠肝炎病毒（MHV）RT-LAMP檢測的原理、方法和結(jié)果判定。本文件適用于實驗小鼠肝炎病毒的檢測。規(guī)范性引用文件本文件無規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification（RT-LAMP）逆轉(zhuǎn)錄-4～6DNAAMV逆轉(zhuǎn)錄酶的混合溶液1h內(nèi)完成核酸擴增反應(yīng)的一種特異、高效、可視化的鏈取代核酸擴增技術(shù)?；驹鞤NA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，利用可以產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物和酶溶液（BstDNAAMV逆轉(zhuǎn)錄酶的混合溶液程中產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀與熒光染料結(jié)合產(chǎn)生的綠色熒光判定反應(yīng)結(jié)果。主要試劑和器材試劑RNA提取試劑盒。脫氧核糖核酸環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試劑盒。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增熒光目視檢測試劑。器材水浴鍋。116116第三篇實驗動物檢測方法系列標(biāo)準環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)管。生物安全柜。組織勻漿機。檢測方法空白對照DEPC去離子水。陰性對照提取不含小鼠肝炎病毒的樣本RNA作為陰性對照。陽性對照提取小鼠肝炎病毒的RNA作為陽性對照。引物F3：5′-AAGCAGTTCCAACCAGCG-3′B3：5′-TGGGCACTGCTTGTTTGG-3′FIP：5′-GGCCGGCATCTTTACCGAGCAAAACCTGATATGGCCGAAGA-3′BIP：5′-GCAAGTAACGAAGCAAAGTGCCAGTCCTCTTTTGGCGAGGC-3′LF：5′-TTAGCCAAAACAAGAGCAGCA-3′樣品的制備1.0g2mL0.1mol/LpH7.2～7.6的磷酸鹽緩沖液（PBS），12000r/min5min，取上清，用病毒RNARNARNA濃度進入下一步驟或–80℃保存?zhèn)溆谩：怂釘U增在反應(yīng)管中配制25μL反應(yīng)體系，見表1。表1小鼠肝炎病毒RT-LAMP反應(yīng)體系反應(yīng)組分 反應(yīng)量2×反應(yīng)緩沖液（RM） 12.5μLFIP引物 40pmol（1μL）BIP引物 40pmol（1μL）F3引物 5pmol（1μL）B3引物 5pmol（1μL）酶溶液（EM） 1μLDEPC去離子水 1.5μL樣本RNA 5μL熒光染料FDR 1μL65℃恒溫下反應(yīng)60min。實驗動物小鼠肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP）檢測方法實驗動物小鼠肝炎病毒逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP）檢測方法117結(jié)果