基因的克隆方法大全第1頁/共42頁2基因的表達(dá)過程mRNA翻譯成蛋白質(zhì)基因組DNA第2頁/共42頁3如何獲得基因？——即基因的克隆方法

基于基因產(chǎn)物的基因克隆方法基于基因加標(biāo)簽的基因克隆方法基于基因序列的基因克隆方法基于基因圖譜的基因克隆方法第3頁/共42頁4一、基于基因產(chǎn)物的基因克隆方法mRNA翻譯成蛋白質(zhì)1、根據(jù)蛋白質(zhì)序列克隆目的基因2、根據(jù)基因表達(dá)差異（mRNA）克隆基因第4頁/共42頁5

原理：根據(jù)蛋白質(zhì)上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后設(shè)計(jì)探針或引物從基因組文庫或cDNA文庫中分離出相應(yīng)的基因。1、蛋白質(zhì)序列克隆法第5頁/共42頁6實(shí)用性：分離純化蛋白質(zhì)十分困難CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA

C

T

GATG

G

G

T

T

C據(jù)某段氨基酸序列推導(dǎo)可能的核苷酸序列注意！密碼子有簡并性現(xiàn)象！第6頁/共42頁72、根據(jù)基因表達(dá)差異（mRNA）克隆基因基因表達(dá)的差異表現(xiàn)：一是基因表達(dá)的種類的不同；二是基因表達(dá)水平的改變。第7頁/共42頁8差減雜交（SH）抑制性差減雜交（SSH）差異顯示PCR（DDRT-PCR）DNA代表性差異分析（DNARDA）擴(kuò)增限制性片段長度多樣性（AFLP）cDNA微陣列已發(fā)展的相應(yīng)基因克隆方法：第8頁/共42頁9

差減雜交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色體的DNA研究。超聲波打斷雌鼠的DNA（過量100倍）(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA

(XY)變性、復(fù)性去除共有序列BamHI酶切表達(dá)載體連接、轉(zhuǎn)化、測序分析缺點(diǎn)：技術(shù)要求高，耗時，工作量大NO.1NO.2NO.3第9頁/共42頁10SH在mRNA研究上的應(yīng)用機(jī)理：

!!不足之處：重復(fù)性差，靈敏度低，回收的cDNA量有限。特異表達(dá)基因的樣本（TS）無特異表達(dá)基因的樣本（RS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄過量雜交TS的CDNA純化、富集、擴(kuò)增去除過量的RS的cDNA及雜交分子第10頁/共42頁11

基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)；

基因時空表達(dá)的研究：如根、莖、葉；

不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。差減雜交技術(shù)的應(yīng)用方面：第11頁/共42頁121.2.2抑制性差減雜交（SSH）Tester樣本mRNADriver樣本mRNASfiIAcDNAcDNASfiIBAB混合，變性雜交過量ABPCR擴(kuò)增5`3`第12頁/共42頁13應(yīng)用基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)基因時空表達(dá)的研究：如根、莖、葉不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照第13頁/共42頁141.2.3差異顯示PCR（DDRT-PCR）最先由Liang等于1992年報道，目前已廣泛在實(shí)驗(yàn)室使用。主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計(jì)象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時結(jié)合5`端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴(kuò)增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA第14頁/共42頁155`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT第15頁/共42頁16第16頁/共42頁17具體操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反轉(zhuǎn)錄；3、特定引物和RP結(jié)合RT-PCR；4、把不同處理的樣品擴(kuò)增產(chǎn)物按引物組合分別進(jìn)行電泳比較DNA帶，從而找出差別DNA。第17頁/共42頁18缺點(diǎn)：假陽性條帶多，對低豐度的基因表達(dá)不容易檢測。工作量大。無法定量研究。擴(kuò)出的條帶往往是3`端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。第18頁/共42頁19

優(yōu)點(diǎn)：簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。所需的mRNA量少。各樣本mRNA的差異可同時進(jìn)行比較。擴(kuò)出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。第19頁/共42頁20二、基于基因加標(biāo)簽的基因克隆方法原理：主要是在生物基因組中插入外源的一段DNA，使生物體產(chǎn)生某種突變表型，然后反過來利用這段外源已知的DNA片段來克隆基因的方法。第20頁/共42頁21外源DNA基因組染色體DNA基因A產(chǎn)生突變型分類：

T-DNA標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法。第21頁/共42頁22T-DNA標(biāo)簽法克隆基因技術(shù)路線：農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個體。建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。把陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測序分析。第22頁/共42頁23野生株轉(zhuǎn)基因株目的基因染色體T-DNA染色體T-DNA探針篩選轉(zhuǎn)基因文庫作探針篩選野生株基因文庫構(gòu)建基因組文庫基因苗構(gòu)建基因組文庫基因苗陽性克隆目的基因獲得陽性克隆基因序列分析，確定為基因陽性克隆轉(zhuǎn)化突變體，確定基因功能第23頁/共42頁24轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子又稱轉(zhuǎn)座因子或者跳躍因子，實(shí)際上也是DNA片段，它可以在生物的染色體組中移動，從染色體的一個位點(diǎn)跳到另一個位點(diǎn)，或從一條染色體跳到另一條染色體上，引起基因功能的改變。第24頁/共42頁25轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法最早是美國玉米育種家1951年發(fā)現(xiàn)，起初不被認(rèn)同，1967年在大腸桿菌的半乳糖操縱子中證實(shí)后得到認(rèn)同。根據(jù)DNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座的機(jī)理，分為兩大家族：轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子，前者如玉米的Ac/Ds系統(tǒng)和spm因子，后者如果蠅的copia因子。第25頁/共42頁26轉(zhuǎn)座子根據(jù)結(jié)構(gòu)不同可以分為簡單轉(zhuǎn)座子和復(fù)雜轉(zhuǎn)座子簡單轉(zhuǎn)座子：可以直接插入到其他位置,也叫插入序列。復(fù)雜轉(zhuǎn)座子：攜帶有其它基因或遺傳標(biāo)記。結(jié)構(gòu)共同點(diǎn)：兩端含有20-40個核苷酸的倒置重復(fù)序列。含有可編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。應(yīng)用：以Ac/Ds系統(tǒng)為例第26頁/共42頁27Ac/Ds系統(tǒng)操作原理把Ac，Ds分別轉(zhuǎn)化并獲得轉(zhuǎn)化體。把Ac轉(zhuǎn)化體同Ds轉(zhuǎn)化體進(jìn)行雜交得到F1代，然后自交得到F2、F3代分離群體，找出穩(wěn)定突變個體。用Ds做probe篩選突變體文庫獲得突變基因的部分序列。用上述序列篩選正常個體基因組文庫或cDNA文庫，得到目的基因。第27頁/共42頁28三、基于基因序列的基因克隆方法

根據(jù)克隆的策略的不同，基于基因序列的基因克隆方法又可以分為兩種形式：通過分子雜交克隆法和通過PCR擴(kuò)增基因法第28頁/共42頁291、通過分子雜交克隆法原理：根據(jù)基因序列上的同源保守性，從一種生物中分離獲得的基因用于制作分子探針，從另一種生物的基因文庫中分離出此生物中的同源基因。第29頁/共42頁301）直接從基因組中擴(kuò)增過程：（1）提取基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定2、通過PCR擴(kuò)增基因法原理：

根據(jù)基因序列結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)基因特異引物，利用PCR技術(shù)直接從生物的基因組或是cDNA中擴(kuò)增出目的基因。第30頁/共42頁31提取基因組DNAPCR引物設(shè)計(jì)真核生物基因組含有內(nèi)含子！此法適合擴(kuò)增原核生物基因。PCR擴(kuò)增基因序列分析第31頁/共42頁32（1）提取基因組

totalRNA（2）反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA作模板（4）PCR擴(kuò)增及序列分析（3）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物2）從mRNA中擴(kuò)增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。適合擴(kuò)增真核生物基因。第32頁/共42頁334、基于基因圖譜的基因克隆方法又稱圖位克隆法，是建立在擁有RFLP等分子標(biāo)記的連鎖遺傳圖和基因文庫，基因產(chǎn)物未知的一種基因克隆技術(shù)，理論上可以分離任何一個突變基因。第33頁/共42頁34染色體分子標(biāo)記A分子標(biāo)記B目的基因陽性克隆轉(zhuǎn)化互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)基因圖位克隆示意圖第34頁/共42頁35圖位克隆基因的一般操作過程：通過遺傳分析構(gòu)建與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記連鎖圖，達(dá)到基因的精細(xì)定位。用與目標(biāo)基因緊密連鎖的兩側(cè)分子標(biāo)記篩選基因組文庫，構(gòu)建包含目標(biāo)基因的基因組物理圖譜。目的基因標(biāo)記1標(biāo)記2標(biāo)記3標(biāo)記4標(biāo)記5第35頁/共42頁36染色體分子標(biāo)記2分子標(biāo)記3目的基因基因組物理圖譜進(jìn)一步精細(xì)定位獲得目的基因第36頁/共42頁37通過染色體步移或染色體登陸技術(shù)對目標(biāo)基因進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)定位，得到陽性克隆。對陽性克隆轉(zhuǎn)化隱性受體進(jìn)行功能互補(bǔ)。基因序列測定及表達(dá)分析等。第37頁/共42頁38影響基因圖位克隆的因素：建立的分子標(biāo)記遺傳圖中標(biāo)記與基因之間的距離大小。基因組的大小及可能存在的大量的重復(fù)序列。基因組文庫的大小及單克隆的大小。成功的例子：水稻Xa21擬南芥的RPM1，RPS2等。第38頁/共42頁