感受態(tài)細胞的制備—LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白月東，1%(W/V)；酵母提取物，0.5%(W/V)；NaCl,1%(W/V),用固體NaOH調節(jié)pH為7.0?7.2，分裝于三角瓶中，滅菌后存于室溫。搖動三角瓶，如果發(fā)現(xiàn)變渾濁，表明已染菌，應棄掉重新配制；—0.1mol/LCaCl2：稱取1.47gCaCl2*2H20(Amresco分裝)溶于100mL去離子水中，滅菌后存于4°C；—離心管(50mL或80mL或100mL)，滅菌；一培養(yǎng)試管，滅菌；—1mL槍頭，滅菌；—1mL加樣槍；一濾紙，用牛皮紙包好后滅菌；—10mL量筒，滅菌；—5mL移液管，用棉花塞入管口，卷于報紙中滅菌；一冰，離心管架；一恒溫搖床，可見分光光度計，玻璃比色杯。接種空白大腸桿菌于3mLLB培養(yǎng)基中，37C劇烈震蕩培養(yǎng)過夜；將已培養(yǎng)好的種子液轉入100mLLB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)至OD650=0.3后，將培養(yǎng)好的細菌置于冰上冷卻10min；4C，4000rpm離心10min收集細菌，倒出上清，將離心管倒置于一干凈濾紙上，將培養(yǎng)基控干；用40mL冰預冷的CaCl2懸浮細菌，用加樣槍沖吸，使菌體盡可能分散。冰上放置30min；4C，4000rpm離心10min收集細菌，倒出上清，再用4mL冰預冷的CaCl2懸浮細菌，這些細菌可以立即使用，或者于4C放置12~24h以增加其敏感性后使用。如果證明所制備的感受態(tài)細胞可用，可以在冰上分裝為100pL每管，再加入100pL甘油(注意：甘油非常黏稠，吸取時應該多一點。)，于液氮或-70C冰箱中存放。存于低溫下的感受態(tài)細胞，一定不能融解。如果已經融解，應丟棄，而不能再凍結保存而繼續(xù)使用。注意事項：本實驗室所用空白大腸桿菌菌株為JM109。空白菌可以于平板上劃線后，用Parafilm包好后存于4°C，也可將液體培養(yǎng)物存于4°C。但如果要長期保存，則應將細菌保存于50%的甘油中，存于-20C或-70C。當接種的細菌是來自于-20C或-70C存放的液體培養(yǎng)物時，接種應迅速，不等解凍，立即從表面刮下一塊冰后，將菌種迅速放回低溫存放；一般于3mLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12h后，菌體已很濃，可以進行擴大培養(yǎng)。于100mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)2~3h后，即可達到對數(shù)生長期。但有時如果由于存放過久，或者已經過數(shù)次解凍，造成細菌生活力下降，則倍增時間會延長；對OD值的監(jiān)測，當肉眼看到菌體已很濃時，于超凈臺上取3mL測OD值。開始可以每30分鐘檢測一次，越到后面檢測的時間就應該縮短；感受態(tài)細胞的制備應該再嚴格無菌的條件下進行。因此，所有操作均應在超凈臺上。也可以在實驗臺上進行，但應在后面放一酒精燈，所有操作都不能遠離火焰。最好每次恰好做感受態(tài)之前，將所有的槍頭和管子都滅一下菌，用酒精棉球將加樣槍的前端擦拭一遍；感受態(tài)細胞的細胞膜比較脆弱，因此一當用冰冷的CaCl2懸浮以后，即不能劇烈震蕩或快速抽吸；根據(jù)我們的經驗，純度較高的含結晶水的CaCl2可以得到好的實驗結果；所有的槍頭和管子均應干凈。如果有可能，都盡量用新的。如果是用的回收的槍頭，一定要看管壁是否干凈。擴大培養(yǎng)用的液體培養(yǎng)基體積可以調整。調整后的CaCl2溶液體積也按比例作相應的放大或縮小。以本方法制備的感受態(tài)細胞的感受效率將隨低溫保存時間的延長而下降，所以最好是現(xiàn)做現(xiàn)用。存于低溫下的感受態(tài)細胞應該在一個月內使用。而對于轉化PCR連接產物，建議用其它的感受效率更高的制備方法。本節(jié)后的附4介紹了一種高感受效率感受態(tài)細胞的制備方法。質粒DNA的轉化—LB液體培養(yǎng)基：見感受態(tài)細胞的制備；-LB固體培養(yǎng)基：于液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉。不用在滅菌前溶化瓊脂粉，滅菌完后，輕輕搖勻。注意不能劇烈搖動，否則可能會使培養(yǎng)基暴沸；—LB平板:將滅菌后的固體培養(yǎng)基冷至60°C左右時，倒入90mm的培養(yǎng)皿中（約30mL。如果先前已加入了抗生素，則還應在超凈臺上晃動培養(yǎng)皿幾次；—200pL槍頭，1.5mLEp管，滅菌；—42C水??；—10pL，200pL加樣槍；—培養(yǎng)試管，滅菌；—恒溫搖床，恒溫培養(yǎng)箱；—菌液推棒；—抗生素儲液，本實驗室所有的質粒篩選所用的抗生素有兩類，氨卞青霉素（Amp）（儲液，100mg/mL，溶于無菌水中，工作濃度100pg/mL，即每毫升培養(yǎng)基取1pL儲液）；四環(huán)素（Tet）（儲液，5mg/mL，先用1/2體積的乙醇溶解，再加入1/2體積的無菌水，工作濃度50pg/mL，即每毫升培養(yǎng)基取10pL儲液。儲液全部于-20C保存）；—冰；如果是凍存的感受態(tài)細胞，先于冰上溶解；加入用于轉化的質粒DNA1pL；冰上放置30min；于42C熱擊60s；迅速放于冰上，5min后進行下一步；將已攝取了外源遺傳物質的感受態(tài)細胞加入培養(yǎng)試管，該培養(yǎng)試管有已預熱至37C的LB液體培養(yǎng)基，使總體積為1mL，溫和震蕩（200rpm左右）培養(yǎng)1h；將復蘇的培養(yǎng)物倒入一Ep管中，4C，4000rpm離心10min，將培養(yǎng)基倒掉，用殘留的培養(yǎng)基懸浮，然后用加樣槍將菌液加到LB平板上，用推棒涂布直至培養(yǎng)基表面無可見的液體，將有培養(yǎng)基的一面向下培養(yǎng)約30min后，倒置培養(yǎng)過夜。注意事項：熱擊時間要根據(jù)所用管子的傳熱效率，薄壁管子的傳熱效率高，熱擊時間可以縮短到45s；熱擊時，要使水浴盡可能不要流動，熱擊后應迅速放回冰上；于37°C復蘇細菌時，不能加抗生素，搖動也不能太過于劇烈；對照的設置對于評價轉化結果非常重要，將10pL感受態(tài)細胞分別涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上，如果感受態(tài)細胞沒有問題，則應該在不含抗生素的平板上生長，而在含有抗生素的平板上不能生長。一般轉化細胞可以用其中的1/3涂布一個平板，2/3涂布一個平板。不過，對于多拷貝質粒，也可以不用離心，取50pL涂布一個平板足矣。質粒DNA的提取—儲液：100mL1mol/LTris-HCl(pH8.0):稱取Tris12.1g,用濃HCl調節(jié)pH為8.0，然后定溶至100mL，滅菌后存于4C；100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)稱取18.6g二水乙二胺四乙酸二鈉，加80mL去離子水，加熱溶解，用固體NaOH調節(jié)pH為8.0，然后定溶至100mL，滅菌后存于4C；100mL10%SDS，稱取10g十二烷基硫酸鈉于80mL去離子水中，加熱溶解后存于室溫;2mol/LNaOH10mL，稱取0.8g固體NaOH溶解，定溶至10mL，于塑料瓶中室溫存放，可以不滅菌?！芤篒：每配制100mL，稱取葡萄糖0.9g(50mmol/L)，1mol/LTris-HCl(pH8.0)2.5mL(25mmol/L),0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL(10mmol/L)，定溶至100mL，滅菌后存于4C；—溶液II：現(xiàn)用現(xiàn)配，每100pL需要2mol/LNaOH10pL(0.2mol/L)，10%SDS10pL(1%)，然后加80pL無菌水；—溶液III：每100mL稱取KAc49.1g,于70mL去離子水中溶解，然后加入冰乙酸11.5mL，定溶至100mL后，滅菌存于4°C；—TE(pH8.0)：每100mL取1mol/LTris-HCl(pH8.0)儲液1mL(10mmol/L),0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL(1mmol/L)定溶至100mL后，滅菌存于4C；—無DNase的RNaseA：將RNaseA溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5),15mmol/LNaCl中，使終濃度為10mg/mL,于100C加熱15分鐘，緩慢冷至室溫，然后存于-20C；—Tris飽和酚(pH8.0)；—氯仿/異戊醇(24：1)；—100%乙醇與70%乙醇，均于-20C存放；—1.5mLEp管，200pL及1mL槍頭，滅菌；—40pL，200pL，1mL加樣槍；一濾紙，1.5mLEp管；—冰；接種一單菌落于3mL含相應抗生素的培養(yǎng)試管中，于37C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜；將全部培養(yǎng)物分兩次倒入1.5mLEp管中,12000g離心1min收集細胞；將Ep管倒置于一干凈濾紙上，將培養(yǎng)基盡可能流盡；將細菌沉淀重懸于200pl冰預冷的溶液I中，劇烈振蕩使細菌沉淀分散；加400pL新配制的溶液II，蓋緊管口，輕柔的快速顛倒Ep管5?10次，然后將Ep管于冰上放置5min；加300pL用冰預冷的溶液III，蓋緊管口，將Ep管顛倒混合15次左右，然后將Ep管于冰上放置5min；2C，12000g離心5min，將上清轉入另一Ep管，加等體積的酚/氯仿，振蕩混勻，2C，12000g離心5min；吸出上清，再加等體積的氯仿抽提；在吸出的上清中加入2倍體積冰冷的乙醇于室溫沉淀2min；2C，12000g離心5min，倒出上清，沉淀用70%乙醇洗兩次。然后倒置于一濾紙上，讓乙醇揮發(fā)干凈;11.高拷貝質粒溶于含5pLRNaseA的50plTE中；低拷貝數(shù)質粒減半。注意事項：細菌培養(yǎng)時間不宜過長，一般以12?16h為宜，如果培養(yǎng)時間過長，培養(yǎng)物會非常粘稠，這會導致離心沉淀的困難；一般細菌培養(yǎng)好以后，應該馬上提取。如果不能馬上提取，于4°C存放時間不能過長；加溶液I分散細菌沉淀比較關鍵，如果分散不好，將直接影響產率；3.溶液I加入后，溶液會非常渾濁，加入溶液II顛倒幾次后，溶液變清，打開管口，會發(fā)現(xiàn)溶液呈鼻涕樣，加入溶液III顛倒后，會發(fā)現(xiàn)有沉淀物形成，該沉淀物位于溶液上層。如果發(fā)現(xiàn)沉淀不能自動聚集，而是呈爛棉花狀，且離心后不能沉到管底，則預示著實驗的失??；培養(yǎng)基的成分非常復雜，如果去除得不太干凈，則有可能影響到后面的酶切效果；乙醇必須去除干凈，否則會造成電泳點樣時上漂；但樣品又不能干燥太久，否則有可能使得質粒DNA沉淀難于溶解在TE中。SDS在低溫下會析出結晶，因此配制溶液II時應先于60C溶解；如果一次要提多個樣品，可以先一起配制溶液II，而后加入每管。但配制時應略大于所需要的量；附：1.苯酚的平衡—重蒸苯酚一8-羥基哇啉一水浴鍋—固體Tris—50mmol/LTris-HCl(pH8.0):稱取6.055gTris，溶于800mL蒸餾水中，用濃HCl調pH為8.0,定容到1L。將重蒸酚于65°C水浴融化；取100mL融化的重蒸酚于一250mL燒杯中，馬上加至少等體積的蒸餾水，同時加入0.1%苯酚體積的8-羥基哇啉，然后加入少量的固體Tris,當Tris溶解后，可看到液面分層出現(xiàn)，加Tris用7.6?8.5的精密pH試紙調pH為8.0(待加入的Tris溶解充分后，停止攪拌，待分層完全出現(xiàn)后，再用pH試紙測上相的pH值)。將上清吸出，加入100mL50mmol/LTris(pH8.0),充分攪拌后，測定上清的pH值。如果不到8.0，則還需要調節(jié)。將上清吸出，再加入100mL50mmol/LTris(pH8.0),充分攪拌后，吸出上清，但要在液面上保留一層液體。倒入棕色瓶中，于4C保存。這樣的飽和酚可以使用2個月。如果超出2個月，則應倒入專用的盛裝回收酚的棕色瓶中，再重新平衡。注意：酚有強烈的腐蝕性，所以操作時一定要小心，注意不能溢出或濺出，并且要戴手套。如果不小心濺到皮膚上，用大量的水沖洗，切忌用乙醇??！由于酚的腐蝕性，所以不用pH計調pH值，只能用pH試紙。Tris一定要溶解充分后，再測定pH值。2.核酸樣品中蛋白質的去除—3mol/LNaAC(pH5.2):稱取40.824gNaAc?3H2O或無水NaAc24.6g，溶于30mL水中，加HAc調pH至5.2,用水定溶至100mL(調pH時，愈到后面，愈應小心)。然后滅菌存于4C。如果是濃縮RNA,還要用DEPC處理后再滅菌。一槍頭和管子：根據(jù)純化樣品的不同而采取不同的處理方式，純化DNA時只需滅菌，純化RNA時則需要DEPC處理后再滅菌?！猅ris飽和酚（pH8.0）；—氯仿/異戊醇（24：1）；一凍存于-20°C的無水乙醇和70%乙醇在核酸樣品中加入1/2樣品體積的Tris飽和酚和1/2樣品體積的氯仿/異戊醇，混勻后，于2C，12000rpm離心5min，將上清轉入一新管中，重復酚/氯仿抽提直至界面無可見的沉淀物為止。加入1倍樣品體積的氯仿/異戊醇，混合均勻后，于2C，12000rpm離心5min，將上清轉入另一新管。加入1/10終體積的3mol/LNaAC（pH5.2），再加入2倍體積的冰冷的無水乙醇，于-20C至少沉淀3h。2C，12000rpm離心15min。沉淀用70%的乙醇表面潤洗2次，將管倒置于一濾紙上，空氣中干燥。然后將樣品溶于適量體積的溶劑中?；靹蚍绞揭鶕?jù)DNA和RNA而有所不同：RNA混勻時，可以劇烈震蕩，而DNA只能用手顛倒混勻。吸取上清液應根據(jù)待純化的樣品是DNA還是RNA而有所不同：DNA吸取要緩慢，RNA則可以不加注意。所加乙醇的體積是以加了鹽后的體積計算的。如果待純化的核酸樣品量太少（＜1瞄）或樣品太?。ǎ?.01瞄似）,則所加乙醇的量應擴大到2.5?3倍。3核酸的濃縮以上所述的去除核酸中的蛋白質后，再用乙醇沉淀即為核酸的濃縮。如果核酸樣品已經很純，則沉淀時無必要加入醋酸鹽；如果核酸樣品中還有雜質需要去除，則還應加入醋酸鹽（NaAc,KAc或NH4AC）。

4?高感受效率感受態(tài)細胞的制備—E.coUM109或其它菌種—LB液體培養(yǎng)基—50mL離心管—LB固體培養(yǎng)基—LB平板—200pL槍頭，1.5mLEp管，滅菌；—42°C水??；—10pL,200pL加樣槍；一培養(yǎng)試管，滅菌；—恒溫搖床，恒溫培養(yǎng)箱；一菌液推棒；—抗生素儲液，本實驗室所有的質粒篩選所用的抗生素有兩類，氨卞青霉素（Amp）（儲液，100mg/mL，溶于無菌水中，工作濃度100pg/mL，即每毫升培養(yǎng)基取1pL儲液）；四環(huán)素（Tet）（儲液，5mg/mL，先用1/2體積的乙醇溶解，再加入1/2體積的無菌水，工作濃度50pg/mL，即每毫升培養(yǎng)基取10pL儲液。儲液全部于-20C保存）；—冰；—SOB培養(yǎng)基（1L）;蛋白胨20g,酵母抽提物5g,NaCl0.58g,KCl0.38g,100X鎂離子母液（每100mL含MgCl2?6H2O20.33g,MgSO4-7H2O24.65g）10mL。用1mol/LNaOH調pH至7.0?！猄OC培養(yǎng)基：SOB+20mmol葡萄糖（每100mLSOB培養(yǎng)基中加入50%的葡萄糖溶液720pL。）—0.5mol/LCaCl—0.5mol/LCaCl2：7.35gCaCl2?2H2O溶于100mLddH2O中。用0.22pm的微孔濾膜過濾除菌?！?mol/LKCl：7.45gKCl溶于100mLddH2O中，高壓滅菌。高壓滅菌?！?.45mol/LMnCl2；8.9gMnCl2-4H2O溶于100mLddH2O中，—0.5mol/L(K-MES)：9.76g2(-N-嗎啡啉)乙磺酸溶于約80mLddH2O中，高壓滅菌。用KOH調pH為6.2，加水定容至100mL,用0.22pm的微孔濾膜過濾除菌。分裝后于-20oC保存?！谆鶃嗧?DMSO)?！猅B緩沖液：10mmol/LK-MES(pH6.2)(0.5mol/LK-MES(pH6.2)2mL),45mmol/LMnCl2(0.45mol/LMnCl210mL,15mmol/LCaCl2(0.5mol/L