關于基因組學與比較基因組學第一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日什么是基因組，基因組學？基因組（Genome）：是指生物體的單倍體細胞中所有的DNA，包括細胞核內的DNA和各種細胞器中的DNA，是生物體內遺傳信息的集合?；蚪M學（genomics）：是研究并解析生物體整個基因組所有遺傳信息的一門學科。第二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日結構基因組學功能基因組學比較基因組學基因組學的發(fā)展：從序列到功能第三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日結構基因組學結構基因組學：基因組計劃基因組作圖測定核苷酸序列基因定位第四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日功能基因組學

功能基因組學：后基因組學（postgenomics)

利用結構基因組學提供的信息和產物，在基因組系統水平上全面分析基因的功能的一門學科。第五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日比較基因組學

比較基因組學：研究不同物種之間在基因組結構和功能方面的親源關系及其內在聯系的學科。

第六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日基因組計劃的主要任務是獲得全基因組序列；現在的測序方法每次只能測800-1000bp，大量的測序片段要拼接；要知道序列在染色體上的位置才能正確拼接，因此需構建基因組圖譜。第七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日教學內容一、高通量DNA序列分析技術二、人類基因組計劃三、比較基因組學第八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日DNA序列分析技術

DNA序列分析鳥槍法測序技術及其改良一、高通量DNA序列分析技術第九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（一）DNA序列分析技術DNA序列測定：是指DNA一級結構的測定，是在核酸酶學和生物化學的基礎上，創(chuàng)立并發(fā)展起來的一門重要的DNA技術學。第十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日DNA序列測定的技術

雜交測序法質譜法單分子測序法原子探針顯微鏡測序法

DNA芯片法經典方法:

雙脫氧鏈末端終止法(Sanger,1977)DNA化學降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技術方法:第十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日是由英國劍橋分子生物學實驗室的生物化學家F.Sanger等人于1977年發(fā)明的。利用雙脫氧核苷酸作為鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法。1980年諾貝爾獎金獲得者F.Sanger1、雙脫氧鏈末端終止法第十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（1）Sanger雙脫氧鏈末端終止法測定DNA序列的基本原理：以DNA合成反應為基礎，加入ddNTP生成特定末端不同長短的DNA片段；聚丙烯酰胺凝膠電泳可以區(qū)分長度只差一個核苷酸的DNA分子。第十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

DNA合成反應

第十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日利用DNA聚合酶不能夠區(qū)分dNTP和ddNTP的特性，在DNA合成反應中，加入ddNTP，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5′-P端形成3′、5′-磷酸二酯鍵，導致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP。第十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

ATP、dATP和ddATP的結構ATPdATPddATP第十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日第十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日這樣以待測序列的DNA為模板，加入引物和4種dNTP（其中一種為α-32P標記），將此反應物分為4等份，每份內加入一定比例的一種ddNTP，如此形成A、T、C、G四個反應體系，最后在各反應體系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。這樣各反應體系中即可形成以一種ddNTP殘基為3’端結尾的一系列長短不一片段。第十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日CAGTTemplatePrimerdATPdNTPPolymeraseTerminator第十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日THEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGAT第二十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日第二十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

DNA模板ATTGCAGTCGAC

生成的新鏈TAACGTCAGCTG

T管：

C管：

TAACGTCAGCT

TAACGTCAGC

TAACGT

TAACGTC

TTAAC

G管：

A管：

TAACGTCAGCTGTAACGTCA

TAACGTCAG

TAA

TAACG

TA

第二十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日第二十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日TAACGTCAGCTGTAACGTCAGCTTAACGTCAGCTAACGTCAGTAACGTCATAACGTC

TAACGTTAACGTAACTAATA

T

第二十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（2）雙脫氧末端終止法主要步驟

單鏈DNA模板的制備DNA模板與測序引物退火延伸-終止反應變性聚丙烯酰胺凝膠電泳放射性自顯影閱讀測序結果第二十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日將DNA克隆到質粒載體將DNA克隆到M13噬菌體載體將DNA克隆到酵母人工染色體——基因組DNA大片段文庫PCR雙脫氧鏈末端終止法要求單鏈作為模板如何得到單鏈DNA？第二十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日2、DNA測序自動化

DNA測序的自動化是在Sanger的雙脫氧鏈末端終止法的基礎上在1987年由美國應用生物系統公司進一步發(fā)展起來的激光測序法，其基本原理與末端終止法一樣，都是通過ddNTP競爭性的終止新合成的DNA鏈。第二十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日DNA測序自動化步驟：

4種帶有不同熒光染料標記的終止物ddNTPsSanger測序反應反應產物電泳分離激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光熒光信號采集、計算機分析與DNA自動排序第二十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA第二十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日THEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATC第三十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日第三十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日以熒光化合物標記雙脫氧核苷酸的自動測序第三十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（二）鳥槍法測序技術及其改良

基因組的每條染色體長度可達數百萬堿基對以上，將鏈終止法測定的小片段DNA組裝成真實的排列順序是一項浩繁而精細的工作。DNA順序的組裝主要方法：全基因組鳥槍法測序改良鳥槍法：大片段克隆法、靶標鳥槍法第三十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日1、全基因組鳥槍法測序鳥槍法的順序組裝是直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊，然后依次向兩側鄰接的序列延伸。第三十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日DNA的鳥槍法測序的主要步驟

第一，建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫。第二，高效、大規(guī)模的末端測序。第三，序列集合。第四，填補缺口。第三十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日鳥槍法測序示意圖第三十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日鳥槍法的優(yōu)勢：

鳥槍法的主要優(yōu)勢在于：測序速度快，并且無須提供相關的遺傳圖譜和物理圖譜。

20世紀90年代末，用鳥槍法在較短時間內成功地完成了流感嗜血桿菌的基因組測序，引發(fā)了一場微生物基因組測序的熱潮。這些研究項目的實施，表明鳥槍法測序可以組建一條流水工作線，一個科研小組可以分工合作，一部分人專門負責制備DNA，一部分人負責測序和數據分析。經驗證明，一個5Mb大小基因組的測序可以在一年內完成。第三十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日鳥槍法的局限：拼接組裝困難：對于結構復雜的大基因組而言，鳥槍法的序列組裝的起始階段工作量非常大。。重復序列的存在：在序列組裝時可能出現錯誤連接，使某些片段從原位置跳到另一無關位置。因此，對于缺少重復順序的小基因組（<5Mb）而言，鳥槍法仍為最佳的選擇，但對于大基因組而言，還需要更加有效的策略。第三十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日第三十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日2、改良鳥槍法（1）大片段克隆法：將基因組DNA分解為若干個較大的DNA片段，構建基因組文庫；根據克隆插入子兩端的DNA序列查找與之連接的克隆建立重疊群；每個克隆可以獨立進行鳥槍法測序；依據克隆重疊群進行序列組裝這種方法又稱為克隆重疊群測序法。第四十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日克隆重疊群第四十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日大片段克隆法第四十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（2）靶標鳥槍法根據染色體上已知基因或遺傳標簽的位置來確定部分DNA片段的排列順序，再逐步確定各片段在染色體上的相對位置，是建立在基因組圖譜基礎上的”鳥槍法”。第四十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日第四十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日教學內容一、高通量DNA序列分析技術二、人類基因組計劃三、比較基因組學第四十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日二、人類基因組計劃人類基因組計劃（Humangenomeproject）于1990年啟動，我國于1999年加入該計劃，承擔其中1%的任務，即人類3號染色體短臂上約30Mb的測序任務。第四十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（一）人類基因組計劃概述1986年諾貝爾獎獲得者R.Dulbecco（杜爾貝科）提出人類基因組計劃——測出人類全套基因組的DNA堿基序列（3X109bp）第四十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日1988年美國能源部和國家衛(wèi)生研究院率先在美國開展人類基因組計劃，并經國會批準由政府給予資助。此后，成立了一個國際間的合作機構——人類基因組織(HumanGenomeOrganization)，由多個國家籌集資金和科研力量，積極參加這一國際性研究計劃。第四十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日1989年，美國國立衛(wèi)生研究院成立了人類染色體研究中心，沃森出任第一任主任。第四十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日1990人類基因組計劃起動；1995第一個原核生物（細菌）基因組測序完成；1996第一個真核生物（酵母）的基因組測序完成；1998第一個多細胞生物（線蟲）的基因組測序完成；2000果蠅和擬南芥的基因組測序完成；人類和水稻的第一張基因組草圖完成；2001人類基因組測序（精細圖）完成；水稻（秈稻和粳稻）基因組草圖完成。2003年4月，人類基因組序列圖（完成圖）完成。人類基因組計劃的進展狀況第五十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成第五十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日2000年6月26日，美國總統克林頓(中)、塞萊拉公司董事長兼首席科學家克雷格·文特爾(左)和人類基因組計劃首席科學家弗胡西斯·柯林斯(右)在華盛頓白宮參加慶祝人類基因組草圖繪制成功。第五十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日人類基因組計劃的科學意義（1）確定人類基因組中約數萬個編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產物及其功能。（2）了解轉錄和剪接調控元件的結構與位置，從整個基因組結構的宏觀水平上理解基因轉錄與轉錄后調節(jié)。（3）從整體上了解染色體結構，包括各種重復序列以及非轉錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結構、DNA復制、基因轉錄及表達調控中的影響與作用。第五十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（4）研究空間結構對基因調節(jié)的作用。（5）發(fā)現與DNA復制、重組等有關的序列。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機制，為疾病的診斷、預防和治療提供理論依據。（7）確定人類基因組中轉座子、逆轉座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質。第五十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日遺傳圖譜轉錄圖譜0.7cM或kb

序列圖譜物理圖譜100kbSTSmap遺傳圖、物理圖、轉錄圖、序列圖（二）人類基因組計劃的工作任務第五十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日1、遺傳圖遺傳圖概念：又稱連鎖圖，是指采用遺傳學技術構建顯示基因或DNA分子標記在基因組上相應位置和遺傳距離的圖譜。第五十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

遺傳作圖是將每條染色體上的基因或DNA標記的相對位置經連鎖分析確定下來，構成圖譜，因此，需借助相應的遺傳標記。遺傳作圖第五十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日遺傳圖譜的標記是什么呢？標記1標記2標記3染色體上的基因和DNA序列均可作為路標,他們由特定的DNA順序組成.路標位于染色體上的位置是固定的，不會更改的，從而而提供了作圖的依據。第五十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日遺傳標記最早的遺傳標記——基因第一代遺傳標記——限制性片段長度多態(tài)性第二代遺傳標記——簡單序列長度多態(tài)性第三代遺傳標記——單核苷酸多態(tài)性第五十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（1）基因是首先被使用的標記孟德爾→豌豆植株高矮、豌豆的形狀等摩爾根—顯微鏡、肉眼→果蠅軀體顏色、翅膀形狀等生化表型→細菌、酵母遺傳學研究；人類中如血型系列（ABO）分析、血清蛋白和免疫蛋白第六十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日基因是非常有用的標記，但并不是理想的，基因標記的缺點：1、可用作標記的基因十分有限，許多性狀都涉及多基因。2、高等生物基因組中存在大量的基因間隔區(qū)，遺傳圖中留下大片的無標記區(qū)段。3.只有部分基因其等位基因成員可以通過常規(guī)實驗予以區(qū)分，因而產生的遺傳圖是不完整的。第六十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（2）限制性片段長度多態(tài)性

（restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP）最早發(fā)現的DNA分子標記：指同一物種的亞種、品系或個體間基因組DNA受到同一種限制性內切酶作用而形成不同的酶切圖譜的現象，稱為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)。第六十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日限制性片段長度多態(tài)性是由于基因組DNA某一位點上的變異引起該位點特異性的限制性內切酶識別位點的改變（原有位點的消失或出現新的酶切位點），致使酶切片段長度隨之發(fā)生變化而產生。第六十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

RFLP多態(tài)性的產生與檢測第六十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日RFLP的優(yōu)點（1）遍布于整個基因組，位置相對固定；（2）無表型效應，不受發(fā)育階段及器官特異性限制；（3）共顯性，可區(qū)分純合子和雜合子；（4）結果穩(wěn)定、可靠；第六十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日共顯性:

兩個親本的性狀在子代個體中同時出現，沒有顯隱關系。第六十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

限制性片段長度多態(tài)性的缺點制備可表現基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難；DNA需要量大，實驗操作較繁鎖，檢測周期長成本費用也很高；RFLP分子標記分布密度過于稀疏，現已逐步被其他類型分子標記所取代。RFLP是最早發(fā)現的分子標記，也被稱為第一代分子標記。第六十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日又稱串聯重復序列，其多態(tài)性主要來自重復序列拷貝數的變化，包括小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。小衛(wèi)星DNA—由15-65bp的基本單位串聯重復而成，長度一般不超過20kb。重復次數（小衛(wèi)星DNA區(qū)的長度）在人群中是高度變異的；按照孟德爾的規(guī)律遺傳微衛(wèi)星DNA/簡短串聯重復（STR、STRP或SSLP），重復單元2-8bp，通常重復10-60次GCTTATATATATATATATATATATATAAGCT（3）簡單序列長度多態(tài)性第六十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日微衛(wèi)星序列（SSR）第六十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日如何檢測SSR根據簡單重復順序兩側的序列設計引物,經聚丙烯胺凝膠電泳分辯.第七十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

SSR標記的優(yōu)點（1）在基因組中隨機分布，檢測的多態(tài)性頻率高；（2）PCR特異引物，重復性好；（3）共顯性，操作相對簡單。第七十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

SSR標記的缺點（1）SSR需要測序和設計引物，因而需要大量的人力、物力和時間；（2）另外其種屬特異性強，開發(fā)所需的費用高昂。

SSLP標記又稱為第二代分子標記第七十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日（4）單核苷酸多態(tài)性

（singlenucleotidepolymorphisms,SNP）SNP是指同一物種不同個體基因組DNA的等位序列上單個核苷酸存在差異的現象。其中最少一種在群體中的頻率不小于1％；如果出現頻率低于1％，則視作點突變。第七十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日人類99．9％的基因密碼是相同的，而差異不到0．1％，不同人群僅有140萬個核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SNP）產生的，它構成了不同個體的遺傳基礎。第七十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日SNP與RFLP和STR標記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記。第七十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日連鎖互換定律的基本內容位于同一染色體上的兩個或兩個以上的基因遺傳時，常有連在一起遺傳的傾向——連鎖；但在配子形成過程中，同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生局部交換的結果導致重組類型的產生——互換（重組）；連鎖的頻率大于重組的頻率。遺傳作圖——連鎖互換分析第七十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日AB

AbaB

ab(25)

(25)(25)

(25)(50)

(0)(0)

(50)(48)

(2)(2)

(48)配子類型(%)獨立遺傳孟德爾第二定律完全連鎖不完全連鎖連鎖遺傳定律ABABabab×第七十七頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日遺傳作圖——連鎖互換分析基因（遺傳標記）在染色體上的位置是相對恒定的，它們之間的重組率也是相對恒定的，不同基因之間的重組率不同。相鄰的兩個基因（遺傳標記）由于重組而分開的概率將低于距離較遠的兩個，所以重組率的大小可反應它們之間在染色體上距離的遠近；因此可通過基因重組率的計算來估算基因（遺傳標記）間的遺傳距離。第七十八頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日遺傳圖距的單位：厘摩（cM）——每單位厘摩為1％重組率如果兩個基因間有1%的重組值，其遺傳圖的距離為1厘摩。計算出不同基因（遺傳標記）之間的重組率，就可以構建出顯示基因在染色體上相對位置的圖——遺傳圖譜。第七十九頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日遺傳作圖的主要方法雜交實驗家系分析

第八十頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

雜交實驗的連鎖分析的程序:

選擇已知基因型的親本→設計雜交方案→獲得交配的子代→分析其表型及基因型第八十一頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日

玉米中的連鎖遺傳

有色飽滿

X無色皺縮

CS/CS

cs/cs

↓

測交：F1CS/c

sXcs/cs（雙隱性）↓

CS/cs

Cs/cs

cS/cs

cs/cs

有、滿有、皺無、滿無、皺自由組合預期：1111實驗結果：40321491524035

親組合重組合

96.4%3.6%第八十二頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日重組率繪制遺傳圖重組率為測量基因之間相對距離的尺度.第八十三頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日與經典遺傳作圖類似，只是統計性狀改為DNA分子標記。

程序：選擇已知基因型的親本→設計雜交方案→獲得交配的子代→分析其DNA分子標記DNA分子標記遺傳圖繪制第八十四頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日物理圖概念：采用分子生物學方法直接將基因或DNA分子標記標定在基因組實際位置的圖譜。以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標簽位點，sequence-taggedsite,STS）為“路標”，以堿基對作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。2、物理圖第八十五頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日STS作圖的原理兩個STS出現在同一片段的機會取決于他們在基因組中的距離，彼此靠的越近，分離的幾率越小，彼此相隔越遠，分離的幾率越大。兩個STS之間相對距離的估算與連鎖分析的原理一樣，它們之間的圖距根據它們的分離頻率來算。第八十六頁，共九十八頁，編輯于2023年，星期日STS作圖原理圖示第八十七頁，共九十八頁