病理技術(shù)在醫(yī)學(xué)科研中的應(yīng)用

病理學(xué)科是一門基礎(chǔ)與臨床之間起著橋梁作用的重要學(xué)科,病理研究方法在技術(shù)工作上又是多方面的,有尸體解剖,大體標(biāo)本的制作,制片(石臘切片,冰凍切片,半薄切片,超薄切片等),組織化學(xué)方法,免疫酶標(biāo)技術(shù),熒光技術(shù),攝影技術(shù)等.

作為實驗技術(shù)人員大量的工作是病理制片技術(shù),即常規(guī)病理切片,特殊染色,以供教學(xué),科研,臨床活檢診斷之用.

第一章

病理技術(shù)的應(yīng)用范圍

幫助臨床查明死因(因素不明的死亡)

手術(shù)后病變標(biāo)本,以明確診斷(臨床活檢)

提供教學(xué),科研的資料

第一節(jié)組織制片的概述

組織制片技術(shù)的應(yīng)用,從1665年由HOOk發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始,已有300數(shù)年的歷史.最早應(yīng)用冰凍切片;隨后又進(jìn)一步運(yùn)用石蠟的硬度,以石蠟包埋組織,制成石臘切片;后來又運(yùn)用明膠,火棉膠,碳蠟和塑料等物質(zhì)的韌性,以其包埋組織而制作切片.

組織制片技術(shù)隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展而發(fā)展.切片染色方法可以顯示不同細(xì)胞和組織形態(tài),以及細(xì)胞和組織中某些化學(xué)成分含量的變化.因此,組織制片技術(shù)是教學(xué),醫(yī)學(xué)和科研中不可缺少的一個組成部分.

第二節(jié)制片的種類

1,組織切片法

任何組織切片必須依靠切片機(jī)將組織切成薄片(厚度以μm計),再進(jìn)行染色而得到結(jié)果.在切成薄片以前必須設(shè)法使組織內(nèi)部滲入足夠的支持物質(zhì),使組織保持一定的硬度,然后使用切片機(jī)進(jìn)行切片.滲透到組織中的支持劑(物質(zhì))有多種,如石臘,明膠,火棉膠和塑料等.冰凍組織切片法是直接運(yùn)用快速冷凍法進(jìn)行切片.

2,組織非切片法

不用切片機(jī),不通過切片手續(xù)而制成組織切片的方法,涉及整體封藏法,浮片法,壓碎法和組織直接印片法.這些方法操作簡樸而快,可根據(jù)制片的需要進(jìn)行選擇使用.

第三節(jié)制片方法的程序

組織切片法制作過程中的各種操作

1,取材與固定

取材是根據(jù)實驗的目的和規(guī)定及病變限度而合理取得組織材料.固定是用化學(xué)藥品把組織本來的結(jié)構(gòu)保存下來,以便觀測研究之用,固定劑同時具有硬化細(xì)胞組織的作用,使制片便于進(jìn)行.

2,洗滌與脫水

洗滌是把滲入組織中的固定劑洗去,防止染色中的結(jié)晶產(chǎn)生.脫水是驅(qū)除組織中的水分,以利于透明和浸蠟.

3,透明與浸蠟(透蠟)

脫水后的組織中水分已被透明可代替,而有助于浸蠟.

浸蠟的目的是使組織有一定的硬度而有助于切片和細(xì)胞組織保持一定的生活時狀態(tài).

4,包埋與切片

用石蠟和其他包埋劑將組織包繞一定的形狀以便于切片.將包埋好的組織塊用切片機(jī)切成一定的厚度(以μm計).

5,貼片(展片,撈片)和染色

將已切妥的切片在溫水中展平整后用載玻片貼上,稍晾趕后再烤片.

染色可使細(xì)胞和組織被染上不同的顏色而產(chǎn)生一定的折射率,便于顯微鏡觀測.

6,封片

切片染色后用膠類物質(zhì)將其封固,以利于長期保存.

二,組織切片的重要程序

1.標(biāo)本切開或取厚塊→組織固定→固定后解決→(石臘切片法)脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→粘片→脫蠟→各級乙醇→水洗→常規(guī)染色或特殊染色→脫水→透明→樹膠封片

2.標(biāo)本切開或取厚塊→組織固定(冰凍切片法)→冰凍切片→粘片→乙醇固定及水洗→常規(guī)染色→脫水→透明→樹膠封片.

第二章

固定,固定液和取材

第一節(jié)組織固定方法

在制作組織切片的過程中,一方面將組織充足固定后才干進(jìn)行制片,特別對石蠟切片,這是不可少的重要環(huán)節(jié).

1,固定的意義

就是使要觀測的組織構(gòu)造盡量接近于它生前的正常狀態(tài).

2,組織固定的目的

1)迅速防止組織,細(xì)胞的死后變化,防止自溶與腐敗,以保持組織和細(xì)胞與正常生活時的形態(tài)相似.

2)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),脂肪,糖,酶等各種成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì),以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿.

3)使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來,而產(chǎn)生不同的折射率,導(dǎo)致光學(xué)上的差異,以便染色后易于鑒別和觀測.

4)固定劑兼有硬化作用,使組織硬化增長組織硬義,便于制片.

5)防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu).

6)通過固定的組織,能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清楚,便于辯認(rèn).

由于固定的目的是在于盡量使組織和細(xì)胞保持與生活時相仿的成分和形態(tài).因此,固定的組織愈新鮮愈好,固定組織時,應(yīng)使用足量的固定液,其固定液的量一般不少于組織塊總體積的4倍以上.

3,固定劑的性質(zhì)

為了可以達(dá)成固定的目的,必須具有以下的性質(zhì):

1)迅速滲入組織而固定原生質(zhì),使短期解剖的組織形態(tài)不至于有較大變化.2)固定液有相稱的滲透力,對組織各部分的滲透力相等,可使組織內(nèi)外完全固定.

3)使組織細(xì)胞中不至于因固定引起人為的改變.

4)在凝固原生質(zhì)以后,增長細(xì)胞對于各種穿透的抵抗力,不至于因以后的解決而使固定后的原生質(zhì)變形.

5)盡也許避免使組織膨脹或收縮.

6)能使細(xì)胞內(nèi)的成分(蛋白質(zhì))凝固或沉淀下來.

7)增長細(xì)胞內(nèi)含物的折光限度,易于鑒別.增長媒染作用和染色能力.

8)使組織變硬,適于制片,但又不使材料太堅硬而松脆.

9)使組織充足固定,便于保存.

第二節(jié)介紹幾種常見固定液

固定劑有簡樸固定劑(液)和混合固定劑兩類.作為較好的固定液,一方面有強(qiáng)滲透力,能迅速地滲入組織內(nèi)部;另一方面不會使組織過渡收縮或膨脹,并能使組織內(nèi)易觀測的成分得以凝固為不溶性物質(zhì);最后能使組織達(dá)成一定硬度,獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強(qiáng)的親和力.

一,簡樸(單純)固定液

1,甲醛(Formeldehyde)

甲醛(福爾馬林)為一種無色氣體,溶于水成為甲醛水溶液,甲醛是一種還原劑,極易揮發(fā)旦有強(qiáng)烈刺激性氣味.在平時常用的甲醛濃度為10%,這是指以10ml甲醛加入90ml的水配成的,此液事實上只有4%的甲醛.

甲醛水溶液滲透力強(qiáng),固定均勻,對組織收縮較少.但經(jīng)乙醇脫水時收縮很大,它能使組織硬化并增長組織的彈性.固定厚度適當(dāng)?shù)慕M織,較為適宜.因早醛為非沉淀性固定劑,它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀;但可與蛋白質(zhì)化合,對脂肪,神經(jīng),及髓鞘的固定很好,也可固定高爾基體,線粒體,又是復(fù)糖的保存劑,使肝糖元變?yōu)槲⒓?xì)的顆粒團(tuán).

使用甲醛固定的陳舊組織,以多血的贓器如脾,肝等,較易發(fā)生黑色或棕黑色的沉淀,稱甲醛色素.

2,乙醇(Ethylalcohol)

乙醇為無色液體,可以水在任何比例下混合.它是一種還原劑,很易被氧化為乙醛,在變?yōu)榇姿?所以不能與鉻酸,重鉻酸鉀,鋨酸等氧化劑混合.

用于固定期以80%—95%的濃度為好,它具有固定硬化脫水等多種作用.高濃度乙醇固定的組織硬化顯著,組織在高濃度乙醇中留置過久,易變脆,也使組織收縮明顯,均可縮小原組織體積的20%.因70%乙醇可較久的保存組織.

此外,乙醇其滲透力較弱,能沉淀白蛋白,球蛋白和核蛋白.因此,乙醇除固定作用外,還具有硬化和脫水作用,所以它在制片過程中用途很大.

3,醋酸(Aceticacid)

醋酸又名乙酸,是帶有刺激味的無色液體,因在室溫15℃時常結(jié)成冰狀——冰醋酸.

特性:

(1)在15℃時成冰狀結(jié)晶,有刺激性味,可溶水,乙醇一般配成5%作為混合固定液.(2)醋酸只能沉淀核蛋白,對染色質(zhì),固定較好,對白蛋白,球蛋白,固定不佳.對脂肪,糖元不能固定.

(3)醋酸能使組織膨脹,因此,可抵償因乙醇,升汞,甲醛等固定液引起的組織收縮和硬化,故常配成混合固定液.

(4)醋酸穿透速度最快,米粒大的組織在單純醋酸固定液中1—2h即可.5%醋酸的pH值在2≈8,此時可停止細(xì)菌和酶的活動,可防止組織自溶變性.

4,氯化汞(Mercurybichloride)

氯化汞俗稱升汞.為白色粉末或針狀結(jié)晶,有劇毒,必須嚴(yán)格保管及注意使用.通常用其飽和水溶液,在室溫的水中飽和度為5%—7%.

特性:

(1)能沉淀蛋白質(zhì),它不能固定脂肪,類脂和糖類.

(2)穿透力較弱,單獨(dú)使用可使組織收縮.因此,多與醋酸和鉻鹽(重鉻酸鉀)配成混合固定液,組織宜薄而小2—3毫米,固定6—18h.

(3)升汞混合液固定的組織對于細(xì)胞的結(jié)構(gòu),特別是核的細(xì)微結(jié)構(gòu),顯示由為清楚.

(4)經(jīng)升汞固定的組織易產(chǎn)生汞鹽的沉著(為棕黑色結(jié)晶)易損害切片刀,因此染色前必須脫汞.

5,苦味酸(Picricacid)

苦味酸是一種黃色結(jié)晶,是一種相稱強(qiáng)的酸.它在水中的溶解度隨室溫而變化,約在0.9—1.2%,在空氣中能自燃,在密閉器中能劇裂爆炸.為使用安全起見,常制成飽和水溶液貯藏保存.

特性:

1)能沉淀蛋白質(zhì),但對脂肪和類脂無固定作用.

2)穿透力很慢,細(xì)胞收縮顯著,但不會使組織硬化.

3)有軟化皮膚的作用,配制的Bouin氏液對頭皮及全身皮膚制片效果甚好.

4)苦味酸固定的組織,固定期間太久會影響HE染色(苦味酸對堿性染料不易著色).

5)苦味酸酒精飽和液為糖元較好的沉淀劑.

6,丙酮

丙酮又名醋酮或本酮,極易揮發(fā),易燃的無色液體,能與水,醇,氯仿,醚及多種溶液混合.

特性:

1)它可以作固定劑,又可作脫水劑,穿透速度快,可使蛋白質(zhì)沉淀凝固,2毫米以下的組織固定半小時至1小時即可.

2)可引起組織較強(qiáng)的收縮使之變硬,對核固定不佳.

3)對某些酶的固定很好,如堿性磷酸酶,酸性磷酸酶等.

4)丙酮一般多與氯化汞,甲醛混合液使用,先用低濃度丙酮再經(jīng)高濃度丙酮固定以減少組織收縮和過度硬化.

7,重鉻酸鉀

1)為橙紅色結(jié)晶,有毒,是強(qiáng)氧化劑,不能與酒精等還原劑混合,常配成0.5%水溶液固定組織.

2)重鉻酸鉀單獨(dú)固定組織不能沉淀蛋白質(zhì),但加入冰醋酸轉(zhuǎn)變?yōu)殂t酸,(即酸化重鉻酸鉀),可使蛋白質(zhì)凝固沉淀.

3)重絡(luò)酸鉀與甲醛混合(臨用時配過久失效)為未酸化的重鉻酸鉀固定劑,是固定線粒體,高爾基復(fù)合體和嗜鉻細(xì)胞等優(yōu)良固定劑,若配成Eenker氏液,能很好的固定細(xì)胞質(zhì),胞核及染色體.

4)重鉻酸鉀穿透速度快,固定組織收縮很小,但經(jīng)酒精脫水時都有明顯收縮.經(jīng)重絡(luò)酸鉀固定的組織必須流水充足洗滌(6—12h),否則影響染色.

5)經(jīng)重鉻酸鉀固定的組織,對酸性染料,如伊紅染色良好,但對堿性料染,如蘇木素較差,若加入升汞及醋酸等,則對細(xì)胞核染色極佳.

以上敘述了幾種單純固定液的性質(zhì)和用途,它們各有其優(yōu)缺陷,但單獨(dú)使用的不多,而混合固定液的應(yīng)用更為廣泛.單獨(dú)固定液如重鉻酸鉀等單獨(dú)應(yīng)用效果不好,若與其他固定劑混合就可以成為優(yōu)良的固定液.

二,介紹幾種常用的混合固定液

1,乙醇——甲醛液(AF液)

配制:95%或無水乙醇90ml加入40%并裝甲醛10ml為常用固定液,取材后立即入此固定液.

此液兼有脫水作用,用于固定肥大細(xì)胞和糖元較好,米粒大小固定4—6h,大塊組織12—24h,固定后不經(jīng)水洗,直接放入95%酒精開始脫水.

2,AAF液

配制:純酒精85ml+醋酸5ml+甲醛10ml

3,Zenker氏液

配制:重鉻酸鉀2.5g+升汞5g+蒸餾水100ml加溫溶解,冷卻過濾,貯于棕色瓶內(nèi),成為貯存液.

用時取此液臨95ml再加入冰醋酸5ml即成.

Zenker氏液為組織學(xué),細(xì)胞學(xué),病理學(xué)常用的固定液,多用于固定一般組織,能使細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色較為清楚,固定期間12—24h,然后沖洗24h,切片脫臘后需脫汞(浸入5%碘酒精10'),脫碘(5%硫代硫酸鈉)→流水洗.

4,Bouin氏液

配制

苦味酸飽和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml

此液滲透快,組織收縮小,固定均勻,此液為常用固定液.它對肝,皮膚,胰臟特染效果好,但此液固定過久對堿性染料的著色有影響.

5,Garnay氏液

配制

純酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml為細(xì)胞極好的固定液,對淋巴組織及腺體固定很好,米粒大的組織固定1—2h,也適宜RNA,DNA及糧元的固定.

6,甲醛——生理鹽水

配制

甲醛10ml+生理鹽水90mlPH值為7此固定液是應(yīng)用最廣的一種,它可以保護(hù)脂類和細(xì)胞核.在作酸性染色時,入V-G,或三重染色之前,還可以再使用第2次固定.

第三章

洗滌,脫水,透明,浸蠟

和包埋,切片

第一節(jié)組織洗滌

一,洗滌的目的

組織在固定后一定要把滲透到里面的固定液洗去,然后再進(jìn)行下一步過程.為防止組織中留有較多的固定液而影響脫水劑,甚至可在組織中發(fā)生沉淀物或結(jié)晶而影響觀測,特別是對陳舊性標(biāo)本更應(yīng)注意流水沖洗,盡也許減少組織中的酸性限度和甲醛色素.對混合性固定液,更應(yīng)及時洗滌,有助于脫水直至切片和染色.

二,洗滌的方法

1.固定劑以水配制者用流水沖洗,可使組織中的固定液隨時溢出和隨時洗去.常用的固定劑是甲醛液(10%甲醛水液),尸檢組織,,大動物組織沖洗時間為24h左右,,小動物組織沖洗時間為2--10h左右.

2.固定劑含乙醇者乙醇或乙醇混合液固定液者,一般不規(guī)定沖洗,如需沖洗必需采用與固定劑中的乙醇濃度相近的乙醇沖洗,不可用水沖洗,也不應(yīng)用濃度相差很大的乙醇沖洗,溶液以除去之.

三,特殊固定液洗滌法

1.重鉻酸鉀用重鉻酸鉀固定的組織可用流水沖洗12--24h,或用亞硫酸,或用1%含水氯溶液進(jìn)行洗滌.

2.苦味酸含苦味酸固定的組織,可用50%或70%乙醇浸洗.

3.氯化汞用氯化汞固定的組織內(nèi)常有一種沉淀物生成,呈棱形或不規(guī)則或略圓的塊狀物,棱形物被認(rèn)為氯化亞汞,不規(guī)則物也許是金屬汞,此種結(jié)晶必需洗去,否則會使組織發(fā)脆,或染色不良.

第二節(jié)

組織脫水

一,脫水的目的和原則

組織經(jīng)固定和水洗后,會有大量水分,而水與苯主線不相融合,所以組織在透明前必須通過脫水這一環(huán)節(jié).就是說用某些溶劑逐步將組織塊吸取的水分置換出來,以利于透明劑和石蠟或火綿膠的滲入,這一過程叫脫水.

1.尸檢及活檢有條件時,將組織分別進(jìn)行脫水,如腦,胰腺,肌肉,胸腺或淋巴結(jié),肝,脾等組織.由于脫水時間差異性較大,最佳是單獨(dú)解決.

2.動物組織應(yīng)區(qū)分動物大,小,如狗組織接近新生兒組織,大白鼠和小白鼠也有差異,前者需時稍長,后者則較短.

3.脫水時間與脫水劑的關(guān)系脫水劑的新舊(純度)影響脫水時間,必須靈活掌握.

4.穿刺組織如腎穿刺,徑胃鏡取得組織等,因組織塊很小,常規(guī)用擦鏡紙包裹,防止丟失.

二,脫水劑的種類和效果

1.非石蠟溶劑的脫水劑如乙醇和丙酮等,其組織在脫水后必須再經(jīng)二甲苯透明才干浸蠟.

2.脫水兼石蠟溶劑的脫水劑如正丁醇等組織在脫水后即可直接浸蠟,不比通過中間溶劑如二甲苯之類的試劑.

脫水種類可根據(jù)須要選擇,目前在病理診斷和實驗性動物研究中,較多地采用乙醇脫水,二甲苯透明和石蠟浸透組織.

脫水方法甚多,最重要的是不應(yīng)驟然進(jìn)行,不能操之過急,否則可引起組織強(qiáng)烈收縮,或使組織發(fā)生變形,而得不到滿意切片.

三,常用脫水劑的使用方法

1,乙醇(Alcohol酒精)

沸點(diǎn)78.4℃,為最常用的脫水劑.脫水能力強(qiáng),并能使組織硬化,能較好地與二甲苯透明劑相溶合.

其缺陷是易使組織收縮,變脆.導(dǎo)致這些缺陷是由于組織在高濃度乙醇(無水乙醇)中停留時間較長,或者加溫脫水的溫度過高.在平常中一般脫水從70%乙醇(人體組織從75%)開始,由低向高的梯度脫水.

一般的脫水順序是:75%,95%①,95%②,無水乙醇①,無水乙醇②.只有脫水充足才干在透明劑中透明.

2,丙酮(Acetone)

沸點(diǎn)為56℃.脫水作用比乙醇強(qiáng),但是對組織切的收縮較大,而價格較高,故一般少用于組織的脫水,重要用于快速脫水或固定兼脫水.脫水時間1—3h.

3,正丁醇(N-Butyl-alcohol)

為無色液體,沸點(diǎn)100—118℃,微溶于水,在100ml水中能溶8.3g,故脫水能力較弱,但能與水,乙醇及石臘混合,故這種脫水的組織塊,可直接浸蠟包埋.

這種脫水劑兼透明劑的最大優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮及變脆.

第三節(jié)組織透明

一,透明的目的

在制片過程中有兩次透明,第一次是脫水以后組織塊的透明,第二次透明是染色以后切片的透明.

組織塊透明的目的是便于透蠟包埋,切片透明的月的就是有利光線的透過,便于顯微鏡下的觀測.

組織塊在浸蠟前,必須通過透明以便使石蠟浸入組織內(nèi),起充足支持硬化組織塊的作用,以便完整切片.

通常根據(jù)透明時間與肉眼觀測相結(jié)合判斷透明限度.

二,常用透明劑的種類和使用方法

最常用透明劑的種類較多,但使用最多的是二甲苯.

1,二甲苯

易揮發(fā),無色透明液體,長期接觸對呼吸粘膜有刺激作用.透明能力強(qiáng),易使組織收縮,變脆,故組織塊在二甲苯中宜久留,特別對小動物組織材料必須嚴(yán)格控制好.

2,甲苯

性質(zhì)雖同二早苯,但透明較慢,時間比二甲苯長一倍多,也易變脆.有時用以代替二甲苯.

3,苯

苯的用途與二甲苯相似,對組織有較小收縮,是較好的透明劑.但也易揮發(fā),易燃.吸入苯能引起中毒,可以較小使用.

4,氯仿

即三氯甲烷.其透明能力比二甲苯及苯差,透明時間長達(dá)24h.不易使組織變脆,能溶于醇,醚,苯等,微溶于水,極易揮發(fā).多用于大塊組織的透明.

5,香柏油

對組織收縮及硬化限度比任何透明劑小,但透明時間長,小塊組織至少12h以上,缺陷它不能溶解石臘,透明以后還需二甲苯補(bǔ)充透明.

6,松節(jié)油,汽油

可作脫水,又可透明,但需用優(yōu)質(zhì)(無雜質(zhì))的工業(yè)汽油也不行,在條件困難時可試用.

第四節(jié),組織浸蠟(透蠟)

浸蠟的目的和方法

組織通過脫水,透明后要用石蠟,火棉膠,碳蠟等支持劑透入內(nèi)部,使其變硬并將組織包埋進(jìn)去以利于切片和觀測,這個過程稱為"透入(浸蠟)"或"包埋".

以石蠟切片的透入即(浸蠟)為例,其目的就是除去組織中"透明劑(如二甲苯等)而代之以石臘,并滲入組織內(nèi)部,把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊,以便切成薄片.

浸蠟的方法是將組織通過二甲苯透明以后,并立即投入到液體石蠟中去.在浸蠟時組織必須通過數(shù)次純石蠟(石蠟Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),這樣可以使石蠟中剩余的透明劑完全除盡,以免影響切片質(zhì)量.

浸蠟劑的種類

1,石蠟石蠟有高熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)之分,一般普遍應(yīng)用熔點(diǎn)為56℃以上的石蠟.低熔點(diǎn)在54℃以下,用于酶的顯示和保存抗原活性.

石蠟分軟蠟(52℃—54℃),硬蠟(56℃—58℃),蜂蠟60℃.

一般氣溫用硬蠟,氣溫低時用軟蠟.

2,火棉膠目前使用火棉膠透入組織較少,用于染色前的覆蓋液較多.

3,碳蠟

4,明膠

第五節(jié)組織包埋

石蠟是動物植物,人體組織制片技術(shù)中極重要且應(yīng)用最廣的包埋劑.包埋蠟須在溫箱內(nèi)經(jīng)多次熔化沉淀后的干凈蠟,包埋較為抱負(fù),其包埋蠟熔點(diǎn)為56℃—58℃.

石蠟包埋的注意點(diǎn):

(1)動作要迅速:特別是冬天,在有多塊組織要包埋時,蠟不久會凝固,就包埋不成.

(2)切而向下埋:組織包埋要平整或按規(guī)定包埋.

(3)包埋的鑷子必須加溫,鑷子溫度又不能太高,否則會燒壞組織.

(4)包埋后待蠟塊冷卻后再放入冷水中,不能太快,否則變形有氣泡.

(5)包埋時組織不能重疊擠壓,否則切片不全會影響診斷.

(6)包埋用的蠟一般為工業(yè)蠟,氣候炎熱可用熔點(diǎn)高石蠟(60℃)

第六節(jié)

組織脫水

透明和浸蠟時間

各種組織的脫水

透明和浸蠟時間

表3-1尸體解剖組織脫水,透明和浸蠟時間表

時間長短均可

5—10h

5—10h

5—10h

2—5h

2—5h

2—5h

30min

30min--1h

30min--1h

1--2h

1--2h

2--4h

75%乙醇

85%乙醇

95%乙醇

95%乙醇

無水乙醇

無水乙醇

無水乙醇

二甲苯

二甲苯

二甲苯

石蠟56℃—58℃

石蠟56℃—58℃

石蠟56℃—58℃

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

時間分派

項目

程序

表3-2動物(鼠)組織脫水,透明和浸蠟時間表

時間長短均可

2—5h

2—5h

2—5h

20min

30min

30min

15min

10min

10min

1h

1--2h

1--2h

75%乙醇

85%乙醇

95%乙醇

95%乙醇

無水乙醇

無水乙醇

無水乙醇

二甲苯

二甲苯

二甲苯

石蠟56℃—58℃

石蠟56℃—58℃

石蠟56℃—58℃

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

時間分派

項目

程序

表3-3外檢組織脫水,透明和浸蠟時間表

時間長短均可

1—2h

1—2h

1—2h

1—2h

1—2h

1—2h

1h

1—2h

1--2h

1--2h

1—2h

2—4h

85%乙醇

95%乙醇

95%乙醇

95%乙醇

無水乙醇

無水乙醇

無水乙醇

二甲苯

二甲苯

二甲苯

石蠟56℃—58℃

石蠟56℃—58℃

石蠟56℃—58℃

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

時間分派

項目

程序

第七節(jié)____組織切片

一,石蠟切片法

1,切片前的準(zhǔn)備工作

石蠟切片是以石蠟作為組織的支持媒介作用.應(yīng)先將包埋的每塊組織周邊過多的石蠟切去,組織四周留2mm的石蠟邊.

在常規(guī)實驗室中須備以下用品

⑴通過清潔液浸泡過的載玻片.

⑵展片盆,染色架,蛋白甘油.

⑶大,中號毛筆,眼科鑷(彎)

2,切片制作過程

⑴將預(yù)先冷卻的組織裝在切片機(jī)固定器上.

⑵切片組織通過粗切,待組織充足切完整,右手旋動切片機(jī)把,切片帶出來之后,用毛筆輕輕托起,再用眼科鑷輕攝蠟片,以正面放入展片盆中,待攤平整后撈片.

⑶撈片在載玻片上的一半以處.

⑷切片附貼后,放在空氣中稍涼干,即可進(jìn)行烤片.

3,切片的注意事項

⑴凡是陳舊,腐敗或干枯的組織不易制好切片.

⑵固定失時或固定不妥的組織,染色時常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺,輪廓不清,出現(xiàn)不等的片狀發(fā)白區(qū).

⑶組織脫水,透明和浸蠟過渡,會導(dǎo)致過硬,變脆,特別是動物組織應(yīng)嚴(yán)格控制.

⑷切片出現(xiàn)橫皺紋常多見于組織固定不牢,或切片刀固定不緊.

⑸切片刀不鋒利,切片時會自行卷起或皺起,更不能順利地將切片聯(lián)結(jié)成蠟帶.切片刀如有缺口存在,更易導(dǎo)致切片斷裂,破碎,不完整等現(xiàn)象.

⑹組織切片機(jī)各個零件和螺絲應(yīng)旋緊,否則將會產(chǎn)生震動,以致切片厚薄不均.

二,冰凍切片法

冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍較廣,對病理學(xué)中的臨床手術(shù)的快速診斷其意義更大.

冰凍切片多用于新鮮組織,甲醛固定組織和冰箱冷藏組織等.組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺上冷卻后再進(jìn)行切片.

_

三,快速石蠟切片

_切片脫蠟?zāi)康囊?guī)定:

徹底脫去切片組織中的石臘,才干使組織細(xì)胞著色,否則成云霧狀,會防礙染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清,無法診斷,脫蠟均用二甲苯冬天需加溫脫蠟10'左右,然后浸入95%%至70%AC去二甲苯丙水洗,使切片清亮.

總結(jié)組織制片過程

收集標(biāo)本(活檢,尸檢,動物實驗→取材固定切塊(1×1×0.3→自來水沖洗(1—2h)→組織脫水(75%A乙醇,85%乙醇,95%乙醇Ⅰ,95%乙醇Ⅱ,100%乙醇Ⅰ,100%乙醇Ⅱ,低溶度乙醇2—4h,高濃度乙醇1h)→組織透明(二甲苯30')→浸蠟(軟,硬蠟,大組織4—16h),組織2—4h,→包埋→冷卻修蠟塊→焊蠟塊→切片→貼片→烤片→切片脫蠟→切片染色(常規(guī)HF和特染).

第四章

染色

一,染色的目的

任何冰凍切片,石蠟切片等假如不通過染色,在顯微鏡下只能看到細(xì)胞及其它組織成分的輪廓,即使由于組織內(nèi)部各種物質(zhì)的折射指數(shù)不同,從光線的明暗上能觀測到一些組織結(jié)構(gòu),但也是極其簡樸有限的.遠(yuǎn)不能滿足觀測和借以診斷的目的.

染色的目的,是將染料配制成溶液,將組織切片浸入染色劑內(nèi),通過一定的時間,使組織或細(xì)胞及其他異常的成分被染上不同深淺的顏色,產(chǎn)生不同的折射率,便于在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀測.因此,染色在組織形態(tài)學(xué),特別是病理形態(tài)診斷,科研和教學(xué)工作中,都具有非常重要的意義和實用價值.

二,___染色的原理

染色就是染色劑和組織細(xì)胞相結(jié)合的過程.有關(guān)兩者結(jié)合的原理,不同學(xué)說,尚未完全清楚,而只一般基本認(rèn)為過程是化學(xué)反映和物理現(xiàn)象.

一染色的化學(xué)反映

在組織細(xì)胞內(nèi),一般有酸性和堿性區(qū)別,酸性物質(zhì)部分能與溶液中的陽離子結(jié)合,堿性物質(zhì)部分能與溶液中的陰離子結(jié)合.在細(xì)胞核中,特別是核內(nèi)染色質(zhì),一般有酸性物質(zhì)組成(其中重要有核酸),故與堿性染料的親和力很強(qiáng),易于染色,以氧化蘇木素微代表的堿性染料中有染色作用的是陽離子.在細(xì)胞漿中則由堿性物質(zhì)組成,所以胞漿與酸性染料有較強(qiáng)的親和力,以伊紅染料為代表的酸性染料中有染色作用的是陰離子.

二染色的物理作用

1.毛細(xì)作用及滲透作用組織有許多小孔,染料由滲透作用進(jìn)入組織,它與組織沒有牢固的結(jié)合,所以是單純的物理作用,不能稱為直接染色作用.因所謂染色必需是染料留貯于組織內(nèi)與組織有較穩(wěn)固的結(jié)合.

2.吸取或溶液作用組織吸取染料,作牢固的結(jié)合,組織的著色與溶液顏色相同,但不是和干燥染料的顏色相同.如復(fù)紅溶液為紅色,所染組織也為紅色,而干燥的復(fù)紅帶綠色.

3.吸附作用吸附作用是固體物理的特性,它能從周邊溶液中吸住一些細(xì)小的物質(zhì)微粒,這些微粒也許是溶于溶液中的化合物,也也許是只在溶液中單獨(dú)存在的離子,如染液中分散的色素粒子進(jìn)入被染物質(zhì)的間隙內(nèi),由于分子的引力作用,色素粒子被吸附而染色.

_

三,染色術(shù)語的概念

(1)普通染色在組織制片技術(shù)中,常規(guī)制片最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色,又稱為常規(guī)染色(HE染色).

(2)特殊染色特殊染色就是為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分,是常規(guī)染色的必要補(bǔ)充,也是染色技術(shù)中不可缺少的部分.它在病理診斷中起到輔助作用.

(3)單一染色選用一種染料進(jìn)行的染色,如用鐵蘇木素染睪丸生精細(xì)胞等.

(4)復(fù)染色用兩種不同性質(zhì)的染料進(jìn)行染色的方法,如用蘇木素和伊紅分別使細(xì)胞核及胞質(zhì)染成兩種顏色.

(5)多種染色選用兩種以上的染料的染色,如Mosson三色染色法

(6)進(jìn)行性,退行性染色進(jìn)行性染色又稱漸進(jìn)性染色,將組織成分著色自淺至深,當(dāng)達(dá)成所需要的強(qiáng)度時,終止染色.此種方法稱為進(jìn)行性染色.一般所采用的染液溶度較低,染色過程中應(yīng)當(dāng)不時在鏡下觀測進(jìn)行控制,這樣才干得到染色強(qiáng)度適中的效果.

退行性染色又稱退性染色,先將組織濃染過度,使其超過所需的限度,然后再用某些溶液脫去多余的染色劑,以達(dá)成適當(dāng)?shù)纳疃?并使不應(yīng)著色的組織,細(xì)胞的某些成分脫去色度,這個環(huán)節(jié)稱為"分化".而最終使應(yīng)當(dāng)著色部分達(dá)成適宜限度.如常規(guī)HE染色中的蘇木素染核與鹽酸水分化過程就是退行性染色.

四,染色與分化劑

在退行性染色中,需用某些特定的溶液把附著在組織細(xì)胞上多余的染色劑脫去,從而使目的物與周邊組織形成鮮明的對比,同時使目的物自身的色澤也深淺適當(dāng).這種選擇地除去多余染色劑的過程,稱為分化,所使用的溶液即為分化劑.分化劑分為三類.

⑴酸性分化劑如鹽酸,醋酸等,它們能和媒染劑(金屬)相結(jié)合形成可溶性鹽類,從而打開了媒染劑和組織細(xì)胞的結(jié)合,使組織細(xì)胞脫色.

⑵化分化劑如苦味酸,鉻酸,重鉻酸鉀和過錳酸鉀等,屬于氧化劑.在染色中通過氧化作用后,使染色劑與組織的某種成分的結(jié)合更牢固.

⑶染分化劑媒染劑能促使組織細(xì)胞和染色劑相結(jié)合.但是將已通過染色的切片再放到媒染劑的溶液中,又可使已經(jīng)和組織相結(jié)合的染色劑脫失,這就是媒染劑的另一種功能,稱之為媒染分化劑.

五,染色中的注意事項

⑴較多的組織切片染色,是通過固定,脫水,透明,包埋,切片,脫蠟等環(huán)節(jié)以后,再進(jìn)行染色;有的是直接冰凍切片后即可染色,這些都是根據(jù)不同的目的規(guī)定而進(jìn)行的染色.

⑵染色準(zhǔn)備工作和染色實驗室的設(shè)立,都是做好染色工作的必要條件.各種器皿的清洗要嚴(yán)格,按染色方法中的細(xì)節(jié)去做.染色試劑的配制時間長短和存放,一定要按化學(xué)性質(zhì)與組織的著色能力進(jìn)行對的掌握使用.實驗室常規(guī)設(shè)立要合理,有條件時,可應(yīng)有通風(fēng)設(shè)備.實驗臺和實驗柜,各種器皿和染色所需物品必須齊全,具有一定的條理性,是開展染色工作和提高質(zhì)量的必要條件.

⑶在染色過程中,即要按照書本的方法去進(jìn)行操作,又要根據(jù)實際情況進(jìn)行靈活運(yùn)用.在實踐中,不斷地總結(jié)經(jīng)驗和教訓(xùn),才干純熟掌握染色方法和提高實際工作能力.

⑷由于染色方法較多,掌握染色種類應(yīng)多一些,對不同的組織選用針對性較強(qiáng)的方法進(jìn)行染色,才干提高染色質(zhì)量.

六,染色中的基本原則

一,染色前的解決

一脫蠟至水凡是石蠟切片必須通過二甲苯脫蠟,各級乙醇至水洗的過程.(切片脫蠟,二甲苯Ⅰ,Ⅱ各5'—10'→95%乙醇ⅠⅡ各5'→75%乙醇5'→自來洗水沖)二甲苯和各級乙醇必須保持一定純度,不能混入其他雜質(zhì)成分,而使染色受到影響.

_

二除去汞鹽沉淀物對于用升汞固定或具有升汞混合固定液的切片,切片脫臘后需脫汞(浸入5%碘酒精10'),脫碘(5%硫代硫酸鈉)→流水洗→染色.

三脫甲醛色素甲醛固定組織時間較長及溫度較高情況下,甲醛易氧化自行分解產(chǎn)生甲酸,導(dǎo)致組織成酸性,此時也許有甲醛色素產(chǎn)生.此種色素?zé)o光澤,不溶于水,乙醇,二甲苯等.對于這種色素可用下列方法除去.

1濃氨水1ml,75%乙醇200ml.切片脫蠟后置溶液中30'或較久→流水洗→染色.

21%氫氧化鉀1ml,80%乙醇100ml.切片脫蠟后置溶液中10'→流水洗5'→80%乙醇5'→蒸餾水洗→染色.

四除鉻沉著物有些組織用含鉻的Zenker氏液等固定,致有鉻沉淀物.可應(yīng)用鹽酸乙醇溶液,或用5%碘酒和5%硫代硫酸鈉水溶液解決.

二,染色后的解決

一染色后的脫水對于大多數(shù)的切片,染色后必需要通過脫水.95%乙醇Ⅰ,Ⅱ各5'→100%乙醇Ⅰ,Ⅱ各5.'

二染色后的透明組織通過脫水核透明后會產(chǎn)生一定的折射率,為防止空氣中的有色素的細(xì)小顆粒沉淀在組織中的不良影響,需加透明解決以使組織切片清楚.二甲苯Ⅰ,Ⅱ各5'透明.

_

三,_染色封固劑

組織制片需隨時檢查和保存,故要有蓋玻片封固.通常用中性樹膠,此封固劑質(zhì)量已普遍應(yīng)用.

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第五章

蘇木素,伊紅染色的

應(yīng)用及其配制

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一,蘇木素染色的應(yīng)用

(1)HE染色在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的組織學(xué),生物學(xué),病理學(xué)及其細(xì)胞檢查中,是必不可少的最基本染色方法.

(2)在病理診斷(活檢),教學(xué),科研工作中都被廣泛應(yīng)用,對細(xì)胞學(xué)的觀測也具有重要價值.

(3)HE染色重要顯示各種組織正常成份和病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu),病理組織學(xué)的基本知識大部分都是從觀測HE染色切片中獲得的.

二,HE染液的配制

⒈蘇木素染液

蘇木素又稱蘇木精,為植物染料,是從蘇木樹樹心提煉出來的天然染料(淡黃褐色粉末),易溶于酒精,甘油,加熱可溶于水.蘇木素自身沒有染色能力,配制時必須加入含金屬的媒染劑(鉀明礬),才干達(dá)成染色之目的,配制后還需通過氧化成熟產(chǎn)生蘇木紅才干進(jìn)行染色(有自然氧化成熟和人工氧化成熟).

配制法有下列幾種

(1)哈瑞氏(harris)蘇木素染液

最常應(yīng)用染色時間為5'—10'

配制

①蒸餾水1000ml

②蘇木素3—5g

③碘酸鈉1g

④鉀明礬50—80g

⑤水醋酸20ml其優(yōu)點(diǎn)是:配后即可應(yīng)用染色力較強(qiáng).

其缺陷是:極易產(chǎn)生金屬膜沉淀.

_

(2)埃利希(Ehrlich),蘇木素染液

配制

①無水乙醇100ml

②甘油100ml

③蘇木精2g

④鉀明礬2—3g

⑤醋酸5—10ml

置于陽光下自然氧化3個月左右成熟.

其優(yōu)點(diǎn)是:染色結(jié)果甚佳,貯存愈久染色愈強(qiáng),并且不需分色.

⒉伊紅染液

蘇木素染色后,需用伊紅染料作對比染色,伊紅著色深淺不一,如膠元纖維粉紅色,肌纖維深紅色,紅血球橙色.這樣細(xì)胞核,細(xì)胞槳著色清楚,鮮明,便于鑒別.

伊紅常用配制有兩種

1)0.5%--1%水溶性伊紅乙醇液伊紅y0.5--1g+95%乙醇25ml+蒸餾水75ml+醋酸1—2滴.

2)伊紅B0.5g+80%乙醇100ml溶解后用

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石蠟切片染色程序

切片脫蠟,二甲苯Ⅰ,Ⅱ各5'—10'→無水乙醇5'→95%乙醇ⅠⅡ各5'→75%乙醇5'→自來洗5'水沖—10'→蒸餾水洗→染細(xì)胞核(蘇木素)3—5'→自來水洗→分化(0.5%鹽酸水)→流水沖30'→返蘭→染細(xì)胞漿(伊紅)1—2〃→95%乙醇Ⅰ,Ⅱ→100%乙醇Ⅰ,Ⅱ→二甲苯透明→封片(中性樹膠)→貼號.

第六章

特殊染色

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一,特殊染色的概念及意義

特殊染色為常規(guī)染色(即蘇木素,伊紅)的必要補(bǔ)充,又稱選擇性染色,只有相對的特異性,如PAS陰性反映它有糖元.

意義:

(1)特染能顯示在常規(guī)染色切片中不明顯的部分,如革蘭氏染色,細(xì)菌染色.

(2)區(qū)別HE染色中不能鑒別的組織病變,如VG染色區(qū)別膠元纖維和平滑肌.

(3)顯示某些常規(guī)染色中不能著色的物質(zhì),如網(wǎng)染才干顯示網(wǎng)狀纖維,常規(guī)HE染色是染不出來的.

因此,特殊染色也是制片染色中不可缺少的組成部分,它在病理診斷常著輔助作用,也為科研提供依據(jù).

二,學(xué)習(xí)特染技術(shù)應(yīng)掌握的重點(diǎn)

(注意事項)

(1)染色方法的成敗,應(yīng)當(dāng)在溫度,濃度,時間和PH值等方面找因素.

(2)注意特染的應(yīng)用范圍,如某種病變應(yīng)用什么方法染色才干達(dá)成目的,一般先在HE切片所見的規(guī)定去選擇適當(dāng)?shù)奶厝痉椒?一種或多種.

(3)必須掌握各種特殊染色的結(jié)果,避免導(dǎo)致錯誤的結(jié)論或嚴(yán)重的誤診,如在網(wǎng)染時把膠元纖維誤認(rèn)為網(wǎng)狀纖維.

(4)盡量要陽性切片作對照,便于選擇特染方法,并與HE切片作對照.

(5)特染的組織,在其固定,脫水根據(jù)規(guī)定選擇.所用的器皿都必須化學(xué)清洗.

三,玻璃器皿的清潔

在病理實驗室可用的玻璃器皿,都必須通過清洗干凈才干使用,清洗的方法依玻璃器皿的新舊而不同.

1,新購玻璃器皿的解決

對于新購買的玻璃器皿應(yīng)先用洗衣粉浸泡洗刷,自來水沖洗后再用1—2%鹽酸水溶液浸泡數(shù)小時后,用自來水沖洗干凈,必要時可用少量蒸餾水洗2次.

2,使用后玻璃器皿的解決

每次使用后的玻璃器皿都必須及時徹底清洗干凈,以供下次實驗之用,如輕視這一環(huán)節(jié),可用的玻璃器皿不夠干凈,則會影響染色效果,甚至導(dǎo)致染色失敗,特別在酶組化和銀離子反映操作過程中更有嚴(yán)格的規(guī)定,使用后的玻璃器皿在一般清洗后,還規(guī)定用硫酸清洗液浸泡.

硫酸清洗液配制

重鉻酸鉀80g

自來水1000ml

濃硫酸(工業(yè)用)120m

新配制的清潔液為紅褐色,反復(fù)使用一段時間后,慢慢變成綠色,說明清潔液已失敗,不能繼續(xù)使用應(yīng)重新配制.

3,玻璃器皿的清洗方法

①任何玻璃器皿都必須用自來水沖洗,然后把殘余藥液或染液洗去.

②用毛刷沾洗衣粉擦干凈.

③自來水沖洗,蒸餾水洗2次.

④把晾干的器皿輕輕置入清潔液浸泡數(shù)日.

⑤取出器皿,用自來水把器皿內(nèi)外徹底沖洗干凈,最后用蒸餾水洗2次.

⑥把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或溫箱中烤干,最后存放櫥內(nèi)備用.

_

四,常用的特染

一,膠元纖維染色(VG染色)

一膠元纖維的分部組成成分

膠原纖維是結(jié)締組織中的三種纖維之一,分布最為廣泛,含量最多.重要分布于真皮,腱,韌帶,骨,透明軟骨,動脈,腸壁,子宮和基底膜等.膠原纖維具有韌性大,抗拉力強(qiáng)的特點(diǎn).膠原纖維單位重要由纖維母細(xì)胞合成.

二膠元纖維染色應(yīng)用

膠原纖維染色在病理診斷上重要用于鑒定梭形,纖維形細(xì)胞腫瘤的組織來源;經(jīng)常要在纖維,平滑肌和神經(jīng)三者之中作出選擇.還能使用于其他的情況下,如觀測動脈硬化的心臟,在H·E切片中,心肌內(nèi)散在的小疤痕灶和心肌均被染作紅色,而作膠原纖維染色可將膠原組織和上肌明顯地區(qū)分開來.初期肝硬化用膠原纖維染色,也可使小葉之間少量增生的膠原纖維突出地顯示出來.

_

苦味酸——酸性品紅法

1.VG染液試劑配制

1%酸性品紅10ml

苦味酸飽和液.90ml

此液常分別配制臨用時加以混合,不能久用.

【染色環(huán)節(jié)】

(1)組織固定于10%早醛液中,常規(guī)脫水包埋.

(2)組織切片脫臘至水.

(3)V—G染液2—5'(酸性品紅1:苦味酸飽和液4--6)

(4)傾去染液,無水酒精急速脫水,用濾紙吸干.

(5)二甲苯透明,中性樹膠封片.

【結(jié)果】

_

膠元纖維呈紅色,肌纖維,胞質(zhì)及紅細(xì)胞黃色.

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二,網(wǎng)狀纖維染色

一網(wǎng)狀纖維染色的形態(tài)特點(diǎn)和染色原理

網(wǎng)狀纖維是網(wǎng)狀結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維.它由網(wǎng)狀細(xì)胞可產(chǎn)生,網(wǎng)狀細(xì)胞是星狀多突的細(xì)胞,核大,著色較淺,核仁明顯,胞質(zhì)較豐實,胞突彼此連接形成細(xì)胞網(wǎng)架.網(wǎng)狀纖維細(xì)而有分支,穿行于細(xì)胞體和突之間,共同構(gòu)成網(wǎng)狀支架.這種纖維用H·E染色一般不易辨認(rèn).若用銀氨溶液浸染能使纖維變成黑色,故又稱嗜銀纖維.

網(wǎng)狀纖維的應(yīng)用比較廣泛,用來鑒定病變組織支架的破壞情況,組織,臟器網(wǎng)狀支架的存在與塌陷,完整與破壞,網(wǎng)狀纖維的分布及走行,有多少,粗細(xì),疏密或有無斷裂形態(tài)變化.

網(wǎng)狀纖維染色的原理

網(wǎng)狀纖維的染色方法很多,但是染色原理基本相同,有以下方面.

(1)氧化氧化的作用是使網(wǎng)狀纖維具有選擇性,不經(jīng)氧化的切片,網(wǎng)狀纖維均不能較好地顯示出來,常用的氧化劑是高錳酸鉀.

(2)漂白一般采用2%草酸,使漂白后無色.

(3)媒染作媒染時多用2%硫酸鐵氨(俗稱鐵明礬).這些試劑可增長網(wǎng)狀纖維對銀氨液的選擇性.

(4)浸銀也稱鍍銀,且不同的銀氨液浸染切片,使銀氨配位化合物與網(wǎng)狀纖維結(jié)合,即帶正電荷的二氨合銀Ag(NHs)+2被具有嗜銀性物質(zhì)的網(wǎng)狀纖維吸附,時間從數(shù)稱鐘到數(shù)分鐘.

(5)還原甲醛液是還原劑,能把與網(wǎng)狀纖維結(jié)合的銀氨配位化合物網(wǎng)狀纖維還原成棕黑色的金屬銀.

二網(wǎng)狀纖維染色的應(yīng)用

⑴用于顯示和鑒別腫瘤的性質(zhì)和來源

1)顯示和區(qū)分癌與肉瘤來源于上皮組織的惡性腫瘤(癌)僅癌巢周邊有網(wǎng)狀纖維包繞,巢內(nèi)癌細(xì)胞之間則沒有網(wǎng)狀纖維分部.來源于間葉組織的惡性腫瘤(肉瘤),瘤細(xì)胞之間往往可見較多的網(wǎng)狀纖存在.

2)顯示和區(qū)分血管內(nèi)皮瘤與血管外皮瘤惡性血管內(nèi)皮瘤的瘤細(xì)胞重要在嗜銀纖維鞘結(jié)構(gòu)以內(nèi),單個細(xì)胞則嗜銀纖維包繞;惡性血管內(nèi)皮瘤的瘤細(xì)胞均位于小血管之間網(wǎng)狀纖維鞘之外,并有豐富的網(wǎng)狀纖維自小血管壁向外呈放射狀包繞癌細(xì)胞.

3)用以鑒別淋巴細(xì)胞肉瘤與網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤等在淋巴細(xì)胞肉瘤中產(chǎn)生的網(wǎng)狀纖維比在正常淋巴結(jié)內(nèi)的網(wǎng)狀纖維鞘為減少,網(wǎng)狀纖維在瘤細(xì)胞間自由行走;而網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的網(wǎng)狀細(xì)胞中會產(chǎn)生較多的網(wǎng)狀纖維,與網(wǎng)狀細(xì)胞緊密粘連,分布于每個細(xì)胞之間.

⑵用于某些腫瘤的診斷根據(jù)染色所顯示的網(wǎng)狀纖維多少,分布及行走特點(diǎn),可用于診斷下列腫瘤.

1)平滑肌肉細(xì)胞之間見有大量平行分布的網(wǎng)狀纖維.

2)纖維肉瘤可見大量網(wǎng)狀纖維存在,并且密集包繞細(xì)胞.

3)滑膜肉瘤其梭形細(xì)胞也產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維,但不如纖維肉瘤多.

⑶用于觀測和研究癌組織的發(fā)生,發(fā)展及其惡性限度癌組織發(fā)生,發(fā)展過程以及癌組織生長速度,可通過網(wǎng)染進(jìn)行觀測和研究,如癌巢周邊的網(wǎng)狀纖維包囊完整,說明癌組織生長較慢,惡性限度低;再如子宮頸鱗狀細(xì)胞癌巢周邊網(wǎng)狀纖維分解,說明癌組織正在擴(kuò)散,其惡性限度較高.

⑷顯示與觀測基底膜的變化上皮樣間葉細(xì)胞,間皮或滑膜等,可形成細(xì)胞巢也可產(chǎn)生少量網(wǎng)狀纖維,壓迫周邊網(wǎng)狀纖維,但為斷斷續(xù)續(xù)的絕不連成一線,不形成基底膜.顯示與觀測基底膜的存在與否,不僅能更有效地判斷其上皮來源,并且有助于區(qū)分不同來源的上皮腫瘤.如甲狀腺髓樣癌系假濾泡,無基底膜;濾泡癌或正常濾泡有基底膜.

⑸用于壞死組織的結(jié)構(gòu)及類型

1)凝固性壞死用HE染色往往為一片紅色的無定形物質(zhì),辨認(rèn)不出網(wǎng)狀纖維支架的形態(tài).用顯示網(wǎng)狀纖維的特殊染色方法,可觀測到初期凝固性壞死處的網(wǎng)狀纖維支架還保存其特點(diǎn).

2)肺結(jié)核干酪樣壞死結(jié)核用網(wǎng)狀纖維染色后,可以弄清其病變的起源與發(fā)展,并可區(qū)分

結(jié)核球的類型,即肺炎型,肉芽腫型,阻塞空洞型.肺炎型的壞死組織中尚存在肺泡狀排列的網(wǎng)狀纖維;肉芽腫型為大量雜亂排列的網(wǎng)狀纖維;阻塞空洞型的內(nèi)容物則看不到網(wǎng)狀纖維.

⑹用于顯示和研究肝組織病變用網(wǎng)狀纖維的染色法,觀測肝臟病變處的網(wǎng)狀支架形態(tài),

分布特點(diǎn)及其破壞情況,可以鑒定和研究其病變性質(zhì),限度及其發(fā)展與轉(zhuǎn)規(guī).

三網(wǎng)狀纖維染色的注意事項

(1)用新蒸餾水配制最佳用雙蒸水配制.

(2)所用玻璃器材及載玻片均要達(dá)成化學(xué)潔凈限度,必要時用粘合劑粘連切片,防止脫片現(xiàn)象.

(3)對乙配制好的硝酸銀液和氨銀溶液,要貯存冰箱中保存待用.

(4)在染色過程中,用染氨銀染液或硝酸銀液的前后應(yīng)用蒸餾水洗浸.

(5)氯化金調(diào)色和硫代硫酸鈉固定的時間不應(yīng)太長,否則會引起網(wǎng)狀纖維染色變淡.

(6)根據(jù)診斷需要,可進(jìn)行胞核染色和其其他套色纖維增染,使色彩更為艷麗,清楚.

(7)切片脫水后及時封片,不宜在空氣中停留時間過長,以免產(chǎn)生色素顆粒.

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【氨銀液的配制】

取10%硝酸銀水溶液5ml于三角燒瓶內(nèi),一滴一滴地滴加氨水(氫氧化銨),并同時搖動容器,硝酸銀碰到氨水立即產(chǎn)生沉淀,當(dāng)其沉淀物被溶解時(不能完全溶解也可),再加入3%氫氧化鈉水溶液5ml.溶液重新產(chǎn)生沉淀,此時再滴加氨水.至其沉淀被溶解后,(為避免氨水加入過量最佳能有少許沉淀物為妥,以免脫片)最后加蒸餾水稀釋至50ml.濾過,貯存于棕色瓶中存放入冰箱備用.臨用前取出恢復(fù)室溫再用.

【染色環(huán)節(jié)】