動物繁殖學實驗第1頁/共91頁2實習目的動物繁殖學實驗是動物繁殖學實踐教學的重要組成部分；為畢業(yè)后從事動物生產(chǎn)科學研究和應用、生產(chǎn)服務管理打下基礎。第2頁/共91頁3實習要求主要學習掌握精液品質(zhì)分析、人工授精、發(fā)情鑒定、直腸檢查等繁殖基本技術；掌握動物超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎移植等技術的基本方法。第3頁/共91頁4實習內(nèi)容1、生殖器官標本觀察；2、人工授精器械、胚胎移植器械的識別和使用；3、理化因素對精液品質(zhì)的影響；4、精液冷凍、解凍與精液品質(zhì)評價；5、直腸檢查；6、超數(shù)排卵、胚胎采集、胚胎移植；7、畜牧場畜群繁殖力調(diào)查與評價。第4頁/共91頁5實習過程安排與理論課在同學期，集中實習，分組進行。根據(jù)實踐操作、考勤、實習報告（實習時間、內(nèi)容、操作技術、體會等）等綜合評定成績。第5頁/共91頁6實驗一公、母畜生殖器官觀察

一、目的要求認識各種公母畜生殖器官的位置、形態(tài)、大小及解剖結構特點；了解生殖器官的結構與生理功能的關系。為學習家畜繁殖學及更好地掌握和應用繁殖技術奠定解剖學基礎。第6頁/共91頁7二、材料和方法（一）材料1．各種公、母畜生殖器官標本、模型及掛圖（或投影）。2．大磁方盤、解剖刀、剪刀、鑷子、金屬探針、投影儀。（二）方法用投影與標本觀察相結合；比較各種家畜生殖器官的異同。第7頁/共91頁8三、內(nèi)容（一）雄性動物生殖器官1、觀察各種動物睪丸和附睪的形狀、相對位置和大體構造。2、副性腺：比較各種動物副性腺的大小、形狀、位置及內(nèi)部構造。①精囊腺：②前列腺：③尿道球腺：3、陰莖和龜頭第8頁/共91頁9（二）雌性動物生殖器官雌性動物可以觀察生殖器官的標本、模型及掛圖，也可以采用腹腔鏡法進行活體觀察。1、生殖器官的組成及位置2、卵巢3、輸卵管4、子宮5、陰道6、外生殖器官第9頁/共91頁10四、作業(yè)1．通過觀察和比較，說明各種公、母畜生殖器官的形態(tài)、大小、相互關系和大體構造以及在活體上的位置有何特點。2．繪出任一種公、母畜生殖器官的標本圖。第10頁/共91頁11實驗二睪丸、卵巢組織學

及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程的觀察

一、目的和要求通過家畜睪丸、卵巢組織切片觀察，了解家畜睪丸、卵巢的組織結構及其形態(tài)。了解精子的發(fā)生和卵子的發(fā)生、卵泡的發(fā)育過程及其形態(tài)。第11頁/共91頁12二、材料和方法（一）材料、儀器1、睪丸、卵巢組織切片；睪丸、卵巢組織學及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程的幻燈片、多媒體投影儀或膠片投影儀。2．顯微鏡、幻燈機或投影儀。（二）方法先結合投影或掛圖進行講解，對睪丸、卵巢組織學結構及精子發(fā)生、卵泡發(fā)育過程有了初步的了解。然后再用顯微鏡進行睪丸、卵巢組織切片的觀察。第12頁/共91頁13三、內(nèi)容、觀察步驟

（一）公畜睪丸的組織學觀察1．低倍鏡觀察（1）被膜（2）睪丸縱隔和中隔（3）睪丸小葉：第13頁/共91頁142．高倍鏡觀察：（1）睪丸小葉的結構（2）間質(zhì)細胞（3）曲精細管的結構（4）足細胞（5）生精細胞（生殖細胞）第14頁/共91頁153．精子發(fā)生過程（spermatogenesis）可分為兩個明顯的時期。第一時期：精細胞生成：精原細胞經(jīng)一系列分裂形成精子細胞。第二時期：精子形成（spermiogenesis）：精子細胞變形成為精子。第15頁/共91頁16（二）母畜卵巢的組織學觀察1．低倍鏡觀察在低倍鏡下找出卵巢表面上皮和白膜，區(qū)分卵巢的皮質(zhì)部和髓質(zhì)部。（1）表面上皮（2）白膜（3）皮質(zhì)部（4）髓質(zhì)部第16頁/共91頁172．高倍鏡觀察（1）卵泡發(fā)育的觀察每個卵泡都由位于中央的卵母細胞和圍繞在卵母細胞周圍的卵泡細胞所組成。有的卵泡在發(fā)育過程中可能退化而形成閉鎖卵泡。卵泡可根據(jù)發(fā)育程度不同而分成下列各期。1）原始卵泡2）初級卵泡3）次級卵泡4）三級卵泡5）成熟卵泡6）閉鎖卵泡第17頁/共91頁18（2）黃體是排卵后的卵泡轉(zhuǎn)變成的富于血管的內(nèi)分泌器官。牛、羊、豬的黃體位于卵巢皮質(zhì)淺層突出于表面。馬的黃體則完全埋藏在卵巢深部。根據(jù)黃體發(fā)育階段而分成下列各期。1）血體期2）血管增生期3）成熟期4）白體期第18頁/共91頁193．輸卵管組織學輸卵管從外向內(nèi)由漿膜、肌層和粘膜三層不同細胞層構成。（1）粘膜上皮固有膜（2）肌層（3）漿膜

第19頁/共91頁204．子宮組織學內(nèi)膜肌層外膜第20頁/共91頁21四、作業(yè)：

1．繪出并注明睪丸曲精細管及其所含細胞的構造圖。

2．繪出并注明卵巢組織結構及卵泡發(fā)育各階段示意圖。第21頁/共91頁22實驗三兔的超數(shù)排卵、胚胎移植

及早期胚胎觀察一、目的和要求通過實驗了解促卵泡素（FSH），孕馬血清促性腺激素（PMSG），人絨毛膜促性腺激素(hCG)的作用。了解卵子的正常和異常形態(tài)結構，認識受精卵和未受精卵之區(qū)別。初步掌握沖卵、檢卵技術，為掌握胚胎移植技術打下基礎。第22頁/共91頁23二、材料和儀器設備1．動物：選擇健康的成年未孕母兔。分組后，用作超排處理的供體。另外，準備兩只母兔，作胚胎移植受體。實驗母兔最好用產(chǎn)過仔的母兔，效果較好。需公兔2～3只。2．藥品：FSH、PMSG、hCG、0.9％NaCl、75％酒精、碘酒、新潔而滅、沖卵液、846麻醉藥。3．器材：玻璃注射器（20ml、10ml、1ml），兔用手術臺、創(chuàng)巾、止血紗布、藥棉、縫針、縫線、消炎粉、青霉素、鏈霉素、剪毛剪、止血鉗、鑷子、手術刀、剪、塑料細管（沖卵管）、表面皿、移卵管、連續(xù)變倍實體顯微鏡。第23頁/共91頁24三、供體兔超排分組及操作步驟FSH處理組：先用碘酒棉球消毒母兔頸部皮膚，每只頸部皮下注射FSH10～15IU或0.15mg（動物所產(chǎn)品）。連續(xù)注射6次，每次相隔10～14h?？偭繛?.9mg/只。最后一次注射FSH后12h，從耳靜脈注射hCG75IU（先用酒精棉球消毒耳朵邊緣）。隨即放置于公兔籠中，觀察是否配種。超排處理后，母兔陰部表現(xiàn)出發(fā)情癥狀，能成功地配種。PMSG處理組：母兔頸部皮膚消毒同上。于頸部皮下一次注射PMSG150IU。之后48～72h時，同上述方法注射同量hCG。即同公兔交配。對照組：頸部皮下注射生理鹽水。其它處理同上。

第24頁/共91頁25四、手術沖胚方法于注射hCG并與公兔交配后24、36或48h，進行沖胚。1．應用乙醚、烏拉糖、846麻醉藥（耳靜脈注射0.3ml/只）等麻醉后，再按外科手術要求打開腹腔。2．將母兔背朝下方固定于兔手術臺上。3．在兔腹部最后兩對乳頭的腹中線部剪毛，用沾滿肥皂液的紗布清洗局部，再用剃須刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由內(nèi)向外進行消毒。然后蓋上創(chuàng)巾并固定。4．用手術刀在腹部正中線處皮膚切開2～3cm長的術口，再在腹壁肌白線上切一小口，用中指墊著以手術剪來擴大剪口。5.沖卵時，注意止血，隨時用溫生理鹽水紗布保溫術部。第25頁/共91頁266.打開腹腔后，沿著子宮輕輕引出輸卵管及卵巢。與卵巢下脂肪組織處，用長夾夾住以固定卵巢。仔細觀察卵巢的變化。記錄排卵點（卵巢排過卵后的小紅點）。7.先在卵巢附近找到輸卵管傘，從傘部插入沖卵管并用手指或夾子固定，另一端接表面皿。另一人用10ml注射器配上9號針頭，吸一管沖卵液（也可用生理鹽水代替）。8.從子宮向輸卵管方向，于子宮角末端和輸卵管交界的無血管處插入針頭，使針頭伸入輸卵管內(nèi)并用手指固定。然后慢慢的推動注射器，將沖卵液注入輸卵管，使沖卵液由傘部收集到表面皿內(nèi)。一般每次5ml即可。注意沖卵液不得流失。第26頁/共91頁27五、胚胎觀察將接有沖卵液的表面皿置于實體顯微鏡下，檢查胚胎的數(shù)量和發(fā)育形態(tài)。正常兔受精卵為卵圓形，直徑約140μm，在透明帶外圍有一厚層粘蛋白層（為兔胚胎特有結構）。卵黃顆粒很細，分布很均勻。容易看到核的變化。在卵黃周隙內(nèi)可見兩個極體。未受精的卵母細胞中，粗細不一的卵黃顆粒清楚可見，且分布不均。不能看到細胞核。在卵黃周隙內(nèi)只有一個極體。一般在交配后24h，受精卵已發(fā)育成2-細胞胚胎。48h即發(fā)育成16-細胞胚胎（早期桑椹胚）。第27頁/共91頁28六、胚胎移植1．受體的選擇：選擇與供體發(fā)情時間一致（相差不超過一天）的受體（自然發(fā)情或超排處理誘發(fā)發(fā)情）。2．麻醉、保定及開腹手術：參照供體處理方法。3．胚胎分裝：先向移卵管內(nèi)吸進少量PBS，接著吸入一點空氣，然后再將胚胎連同少量PBS吸入，接著再吸入一點空氣和PBS,在移卵管尖端需保留一端空隙。這樣就可防止胚胎丟失。4．移植部位：將胚胎移入排卵側(cè)的生長道內(nèi)。凡從供體輸卵管內(nèi)得到的胚胎應移植到受體輸卵管內(nèi)。從輸卵管傘部插入2～3cm深，輕輕地注入胚胎，然后慢慢地抽出移卵管。一般一側(cè)輸卵管可移植5～10枚胚胎。如從供體子宮內(nèi)收集的胚胎也應移植到受體母兔相應的部位。5．按外科手術要求分別縫合肌層和皮膚。并進行消毒。注意術后護理。第28頁/共91頁29七、作業(yè)簡述實驗過程和結果，根據(jù)結果進行分析。第29頁/共91頁30實驗四小鼠超數(shù)排卵及早期胚胎的質(zhì)量鑒定一、目的和要求通過實驗及操作，使學生了解孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）對卵巢機能的生理作用，掌握超數(shù)排卵方法和早期胚胎的質(zhì)量鑒定。充分認識正常與異常胚胎的形態(tài)結構及等級劃分標準，為大家畜超數(shù)排卵和胚胎移植打下良好的基礎。第30頁/共91頁31二、材料1．實驗動物：5～6周齡昆明白系雌性小鼠為超數(shù)排卵的供體，成年同系公鼠與之1:1配比。2．藥物與試劑：PMSG、hCG、75％酒精、沖胚液（mPBS）、礦物油。3．器材：一次性1ml注射器、鑷子、剪刀、表面皿、巴氏吸管、Ф直徑35mm培養(yǎng)皿、實體顯微鏡等。第31頁/共91頁32三、超數(shù)排卵方法及胚胎采集取5～6周齡昆明白系雌性小鼠，間隔48h分別腹腔注射10IUPMSG和hCG，hCG注射后與性成熟公鼠合籠，次日檢查陰道栓。有栓雌鼠在注射hCG后78～84h處死、摘取子宮。在實體顯微鏡下，用含有mPBS液的1ml注射器將子宮置于表面皿中沖洗3遍，以回收桑椹胚及早期囊胚。操作液和胚胎置于37℃恒溫臺上保存。第32頁/共91頁33四、胚胎質(zhì)量鑒定將回收的胚胎用mPBS洗凈后，移入新鮮的覆蓋有礦物油的100μlmPBS液滴中，在4×10倍以上實體顯微鏡下進行胚胎質(zhì)量鑒定。（一）胚胎的級別劃分目前對胚胎的質(zhì)量鑒定基本上采用形態(tài)學的方法將胚胎分為A級（1級）、B級（2級）、C級（3級）和D級（4級）四個級別。其中A級和B級胚胎為可移植胚胎。第33頁/共91頁34（二）異常胚胎異常胚胎指胚胎體積過小、過大、呈橢圓形、扁形、帶有大型極體，細胞內(nèi)有大空泡，透明帶破裂、收縮，卵裂球色澤發(fā)暗、界限不清、個別萎縮、邊緣變得粗糙，空透明帶，在透明帶內(nèi)無一定結構的變性胚胎等。

第34頁/共91頁35（三）未受精卵呈圓球形，外周有一圈折光性強且發(fā)亮的透明帶，中央為質(zhì)地均勻色澤較暗的細胞質(zhì)，透明帶和卵黃膜之間的空隙很小甚至看不到。第35頁/共91頁36五、作業(yè)將觀察到的不同發(fā)育階段的正常胚胎、異常胚胎或未受精卵繪圖并加以說明。第36頁/共91頁37實驗五人工授精器材的認識和假陰道的安裝一、目的和要求

1．熟悉人工授精所用的采精和輸精器材,了解其用途及使用方法。

2．練習假陰道的安裝方法。第37頁/共91頁38二、材料和儀器設備1．采精器材：各種公畜采精用假陰道，牛、羊電刺激采精棒，豬手握法采精用的橡膠手套等。2．輸精器材：各種母畜輸精器、陰道開張器、額燈和手電筒。3．輔助器材及藥品：高壓滅菌器、酒精燈、長柄鉗、鑷子、玻璃棒、棒狀溫度計、漏斗、量杯、滅菌凡士林、70％和95％酒精棉球、滑石粉、來蘇兒、洗衣粉等。第38頁/共91頁39三、方法和步驟先講解人工授精器材的構造、各部名稱和用途，并作假陰道安裝的示范。然后學生分組觀察并作假陰道的安裝練習。（一）人工授精器材的認識：1．假陰道：長筒狀，由外殼、內(nèi)胎和集精杯（管）三個主要部分組成。外殼內(nèi)胎集精杯（管）2．輸精器：蘇式牛、羊輸精器為一長頸玻璃注射器。目前常用的為金屬或塑料制成的輸精管，其后連接一個橡皮球。冷凍細管精液輸精則使用特制的卡蘇槍或輸精器。對一些家畜的輸精需借助陰道開張器和額燈或手電筒照明進行。開張器的種類和大小因畜種而異。第39頁/共91頁40（二）假陰道的準備要點1．假陰道外殼及內(nèi)胎的檢查2．采精器材的清洗3．內(nèi)胎的安裝：4．消毒5．集精杯（管）的的安裝6．注水：7．涂潤滑劑：8．調(diào)節(jié)假陰道內(nèi)腔的壓力：9．假陰道內(nèi)腔溫度的測量：10．用一塊褶成四折的消毒紗布蓋住假陰道入口，以防灰塵落入，即可準備采精。第40頁/共91頁41(三)輸精器材的準備金屬和玻璃制成的輸精管、輸精槍，最好用高壓蒸汽消毒，在輸精前最好將輸精管用稀釋液沖洗1～2次。細管冷凍精液的輸精器一般由金屬外殼和里面的推桿組成。使用前金屬外套應進行消毒，前端的金屬套不能連續(xù)使用。使用時將細管的一端剪去，另一端插在輸精槍的推桿上。借助推桿，推動細管中的活塞即可將精液推出。若采用開張器法輸精，需對開張器先進行嚴格消毒方可使用。

第41頁/共91頁42四、作業(yè)指出各種公畜采精器材的異同及優(yōu)缺點，試提出改進意見。第42頁/共91頁43實驗六精液品質(zhì)的肉眼檢查及精子活率評定一、目的和要求掌握檢查精子密度、評定活率的方法；熟悉肉眼檢查精液品質(zhì)的方法；驗證觀察理化因素對精子運動及生存能力的影響。

第43頁/共91頁44二、材料和儀器1．精液：牛、豬或兔等任一種動物的精液。2．藥品器械：顯微鏡、顯微鏡保溫箱（或顯微鏡恒溫臺）、載玻片、蓋玻片、搪瓷盤、溫度計、滴管、擦鏡紙、紗布、試管、3%和0.9%氯化鈉溶液、2%煤酚皂溶液、1/1000新潔而滅溶液、76%酒精、5%伊紅、1%苯胺黑。3．精子密度的投影圖表第44頁/共91頁45三、內(nèi)容和方法（一）精液的肉眼觀察觀察測定下列各項結果并記入登記表內(nèi)。1．射精量2．色澤、氣味3．云霧狀的觀察第45頁/共91頁46（二）精子密度的檢查（顯微鏡觀測法）及活率評分1．檢查精子的密度密——在整個視野中精子的密度很大，彼此之間空隙很小，看不清各個精子個體運動的情況。每毫升精液含精子數(shù)約在10億個以上。登記時以“密”字。中——精子之間空隙明顯，精子彼此之間的距離約有一個精子的長度，有些精子的活動情況清楚可見。這種精液的密度評為“中”，每毫升所含精子數(shù)約2～10億個之間。登記時以“中”字。稀——視野中精子稀疏、分散，精子之間的空隙超過一個精子的長度。這種精液每毫升所含精子數(shù)在2億以下。登記時以“稀”字。第46頁/共91頁472．評定精子的活率必須于采精后立刻在25℃左右的實驗室內(nèi)進行，最好在37℃保溫箱內(nèi)或加熱的載物臺上進行。在評定精子活率的同時也可以測定精子的密度。用玻璃棒蘸取一滴原精液或經(jīng)稀釋的精液（馬、豬精液的精子密度低，不須稀釋；而牛、羊精液的密度大，須用0.9%氯化鈉溶液稀釋，其溫度須與精液密度相近），滴在潔凈的載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，其間充滿精液，不存留氣泡。也可滴在蓋玻片上翻放于凹玻片的凹窩上。置于顯微鏡下，放大250～400倍檢查。注意顯微鏡的載物臺須放平，最好是在暗視野中觀察。第47頁/共91頁48（三）死活精子百分率測定：（1）將5%的伊紅和1%的苯胺黑按1:1混勻，分裝于1～2ml容量的試管中（加入試管容量的1/2），并在37℃水浴中加溫，隨后加入原精液1～3滴，搖勻后再放回水浴中，3min后立即取出待用。（2）從以上混合液中用火柴棍沾上一小滴于載玻片的一端，用另一載玻片進行推動制成抹片，待干燥后，高倍鏡鏡檢（500～600倍）。抹片時，最好在35～40℃的條件下制作，而且制作過程要快。

第48頁/共91頁49實驗七精子密度計數(shù)檢查及精子生理特性的測定一、目的和要求由于目測法不夠準確，所以采用精子計數(shù)的方法測定1ml精液內(nèi)的精子數(shù)。要求要熟練掌握此法，它是目前許多簡單而實用方法的基礎。

第49頁/共91頁50二、精子呼吸強度的測定（一）材料和設備1．新鮮的?；蜓蚓海ㄆ渌倚笠部桑?。2．器材：毛細玻璃管、載玻片、小燒杯、水浴鍋、試管、試管架、滴管。3．試劑：美蘭溶液：取美蘭100mg，溶解于100ml的1%NaCl溶液中，然后置于容量瓶內(nèi)保存三天，再用1%NaCl溶液稀釋10倍。（二）方法和步驟取美蘭溶液與精液各一滴于載玻片上?；靹蚝?，吸入到兩段毛細管中約2～3cm，一段置于37～40℃條件下，另一段置于10℃條件下，比較和觀察美蘭退色所需要的時間。

第50頁/共91頁51三、精子密度的計數(shù)檢查（一）器材普通顯微鏡、血球計數(shù)器、紗布、95%酒精、乙醚、3%NaCl、保溫瓶、溫度計、藥棉、試管、滴管等。

第51頁/共91頁52（二）器材介紹1．介紹血球計數(shù)室的構造（用多媒體或投影儀）。2．介紹血球吸管的構造及各種家畜應該使用何種血球吸管（紅血球吸管或白血球吸管）。（1）牛、羊、雞的精液（密度高）用紅血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3%NaCl至“101”刻度，為稀釋200倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“101”刻度，則為稀釋100倍。

2）豬、馬、兔的精液（密度低）用白血球吸管：若將精液吸至“0.5”刻度處，然后再吸3%NaCl至“11”刻度，為稀釋20倍。如將精液吸至“1.0”刻度處，再吸3%NaCl至“11”刻度，則為稀釋10倍。第52頁/共91頁53（三）方法和步驟1．將計數(shù)室推上蓋玻片。2．將蓋好蓋玻片的計數(shù)板置于低倍鏡下觀察，首先要求找到清晰的計數(shù)室。3．用血球吸管吸精液，用藥棉擦去吸管尖端外圍附著的精液，并用3%NaCl稀釋，因不同的家畜用不同的吸管稀釋。4．吸管吸好精液和3%NaCl以后，用拇指及食指堵住吸管兩端進行來回的充分搖動，混勻。然后棄去吸管中的前兩滴，再將吸管尖端置于血球計數(shù)室和蓋玻片交界處的邊緣上，吸管內(nèi)的精液自動滲入計數(shù)室內(nèi)，使之自然、均勻地分充滿計數(shù)室。注意不要使精液溢出蓋玻片，也不可因精液不足而使計數(shù)室內(nèi)有氣泡或干燥處，否則，應重新操作。靜放2分鐘，開始計數(shù)。5．鏡檢和計數(shù)：移到高倍鏡下檢查。首先數(shù)出四角和正中間的五個方格中的精子數(shù)，也就是80個小方格中的精子數(shù)。載物臺要平置，不能斜放。光線不必過強。

第53頁/共91頁54（四）注意事項：1．若精子壓計數(shù)室的線，則以精子頭為準，按照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則計數(shù)。2．為了減少誤差，應對同一樣品做2～3次重復，求其平均值。如果計數(shù)的結果相差較大，則應進行再次檢查。第54頁/共91頁55四、作業(yè)寫出實驗過程及其精子計數(shù)結果。第55頁/共91頁56實驗八精子形態(tài)和畸形率的測定一、目的和要求由于所需時間等原因，無需對每次采精進行精子畸形率的測定。但應當每月對每一頭種公畜進行一次畸形率的測定，以繪出精子畸形率變化圖。畸形率突然增高，表明存在問題，應當查找和分析原因?；温试?5％以內(nèi)，受精力一般不受影響?；尉右话悴槐憩F(xiàn)前進運動，因而隨著畸形精子數(shù)增多，精子活率下降。如在檢查精子運動力時，可觀察到許多畸形精子，也需要進一步作形態(tài)學檢查。通過本實驗，了解家畜精液中精子形態(tài)與精液品質(zhì)的關系，掌握精子形態(tài)的分類和分析方法。第56頁/共91頁57二、材料和儀器設備精液、染色液、高倍顯微鏡、相差顯微鏡等。第57頁/共91頁58三、方法和步驟（一）威廉氏染色法：觀察精子頭部形態(tài)的染色方法。1．染色液復紅（又稱品紅）染色液：復紅原液（10g復紅溶于100ml96％的酒精）10ml加5％的石碳酸（苯酚）100ml。取上述混合液50ml加飽和伊紅酒精溶液25ml放置兩周后即可使用。美蘭（又稱甲基蘭）染色液：美蘭溶液（10g美蘭溶于1000ml96％的酒精中）30ml加0.01％KOH100ml過濾后再加入3倍量的蒸餾水，混合后即可使用。第58頁/共91頁592．染色程序（1）先制作精液抹片，要求薄而均勻。然后風干或用酒精燈火焰固定。（2）浸入無水酒精中固定2～3min，取出風干。（3）浸入0.5％氯胺T中1～2min。（4）用清水洗1～2min。（5）迅速通過96％的酒精、風干。（6）放入石碳酸復紅染色液中10～15min。清水中沾2次。（7）迅速通過美蘭染色液。（8）水洗后風干第59頁/共91頁60（二）蘇木精—伊紅染色：用以觀察精液中非精子有形成分的類型和比例。細胞核染成藍色，細胞漿呈紅色。蘇木精溶液：2g蘇木精溶于100ml無水酒精中，加入100ml蒸餾水，100ml甘油，3g冰醋酸和10g鋁酸鉀混合，放置14天后使用，用前震蕩。伊紅染液：1g伊紅加入100ml95％的酒精，染色時，取一定量的該液加入等量70％的酒精。

第60頁/共91頁612．染色程序（1）制備間斷式的精液抹片（即當推制抹片時，不要一推到底，而要斷續(xù)前推，使抹片厚度有一個梯度變化，染色后易于觀察不同類型的精子成分），風干。（2）浸入無水酒精中固定3～5min，風干。（3）分別浸入95％、75％的酒精和蒸餾水中各1min。（4）浸入蘇木精染色液中5min。（5）浸入伊紅染色液中1～2min。（6）水洗1～3min。（7）通過70％和無水酒精。（8）風干后，用二甲苯加蓋片封存。如不保存，直接觀察。

第61頁/共91頁62（三）精子尾部形態(tài)的觀察

1．福爾馬林—緩沖液的制備將21.82g二水磷酸氫二鈉和22.25g磷酸二氫鉀分別溶于500ml蒸餾水中，取200ml磷酸氫二鈉溶液加80ml磷酸二氫鉀溶液，配成緩沖液。取該緩沖液100ml，加入40％（V/V）福爾馬林溶液62.5ml，最后加蒸餾水至500ml。

2．觀察程序（1）將福爾馬林—緩沖液注入容量為1ml的小玻璃管中，然后置37℃恒溫箱中備用。（2）根據(jù)原精液的濃度，向裝有福爾馬林—緩沖液的小管中注入2～5滴精液充分混合。（3）取一滴混合后的精液置于載波片上，加蓋片后靜止數(shù)分鐘?？稍?00倍的相差顯微鏡下觀察精子尾部的形態(tài)。隨機觀察400個精子，計算各種尾部畸形精子所占的比例。第62頁/共91頁63（四）精子形態(tài)的分類

1．頭部畸形的精子包括：窄頭、頭基部狹窄、梨形頭、圓頭、巨頭、小頭、頭基部過寬、雙頭、頂部脫落等。但以前六種居多。

2．尾部畸形精子包括：帶原生質(zhì)滴的精子（近端、遠端）、無頭的尾（它和無尾的頭往往是一個精子的兩部分，在分析時一般算作尾部的畸形）、單卷尾、多重卷尾、環(huán)形卷尾、雙尾等。

3．中段畸形包括：頸部腫脹、中段纖絲裸露、中段呈螺旋狀、雙中段等。第63頁/共91頁64（五）非精子有形成分多為精子形成過程中的某些退化物，生殖上皮的脫落物和血細胞等。這些成分在精液中出現(xiàn)的比例和類型在一定程度上能反映睪丸和精液排出管道的生理狀態(tài)。在精液中經(jīng)常出現(xiàn)的有：白細胞、紅細胞和鱗狀上皮細胞等。

第64頁/共91頁65四、作業(yè)繪出你所觀察到的各類畸形精子。第65頁/共91頁66實驗九精子頂體染色觀察一、目的和要求頂體在精子受精過程中起著重要的作用。因它能釋放蛋白質(zhì)分解酶消化卵丘細胞之間的粘合基質(zhì)，使精子能夠通過卵的被膜進行受精。由于頂體結構的畸形，可導致受精率降低或者不受精。精子老化或損傷，會引起頂體帽破壞，先是頂體嵴部分變化，最后整個頂體消失。這些變化可用電鏡觀察到。但用微分干涉差顯微鏡及相差顯微鏡也能看到。精液冷凍解凍會損傷一些精子，重要的是要準確知道受傷精子百分數(shù)。優(yōu)質(zhì)奶牛精液冷凍前，約90％精子具有完整的頂體。冷凍后下降至60％～65％。研究表明，頂體完整率和不返情率之間比精子活率與不返情率之間相關性更強。因而，檢查精子頂體完整率很重要。通過本實驗，1）學習精液抹片染色技術；2）觀察正常精子頂體和異常精子頂體形態(tài)，計算精子頂體完整率。

第66頁/共91頁67二、材料和儀器設備（一）二人一組，每組所需材料及器材：燒杯2個（大小均可，用于清洗染色片用）；玻璃滴管2支；小磁盤、染色架各一個；衛(wèi)生紙（墊在小磁盤內(nèi)，以免磁盤被顏色污染）；玻璃平皿1個；切片盒一個；血球計數(shù)器2個；普通光學顯微鏡1臺；鑷子1把。

第67頁/共91頁68（二）公用器材酒精棉球；姬姆薩（Giemsa）原液（預先一個月前配好）；固定液；擦鏡紙；精液；蒸餾水；玻璃移液管；玻璃滴管2支，小鑷子2把；pH試紙；玻璃棒2支。第68頁/共91頁69（三）試液的配制1．磷酸鹽緩沖液：Na2HPO4·12H2O2.2gNaH2PO4·2H2O0.55g

先用少量蒸餾水溶解，再用蒸餾水定容至100ml

用pH試紙測pH值，應為7.0～7.2。2．福爾馬林磷酸鹽固定液：（1）Na2HPO4·12H2O2.25gNaH2PO4·2H2O0.55g

置于100ml容量瓶中，加入0.89％NaCl溶液約30ml，使之溶解。（2）加入甲醛MgCO3飽和液8ml

甲醛MgCO3飽和液配制方法：在500ml福爾馬林（40％甲醛）中加入8gMgCO3。此飽和液必須在一周前配好。（3）用0.89％NaCl溶液少許沖洗裝過甲醛的量筒置于容量瓶中，并定容至100ml。此液配好后，第二天即可用。一般在室溫下保存。此液pH為7.0～7.2。第69頁/共91頁703．Giemsa原液：Giemsa原料：1g甘油：66ml甲醇：66ml將Giemsa染料置于研缽中，先加入少量溫熱（60℃）的甘油，充分研磨至無顆粒呈漿糊狀。再將剩余甘油全部倒入，置56℃恒溫箱中保溫2小時。分次用甲醇清洗容器于棕色瓶中保存。保持一個月后才能使用。此原液放置時間越長越好，但使用前需經(jīng)過濾。4．Giemsa染液：必須在染色前配制。Giemsa原液:緩沖液:蒸餾水的比例為2:3:5。第70頁/共91頁71三、頂體染色方法步驟先準備潔凈的載波片。用洗滌靈擦洗，清水沖洗，在用蒸餾水漂洗，以不掛水珠為凈。烘干或涼干備用。1．抹片2．風干3．固定4．水洗5．染色6．水洗第71頁/共91頁72四、精子頂體觀察將精液染片置于顯微鏡下，先用低倍鏡找到精子，再在1000倍下進行油鏡觀察。精子頂體呈紫色，包圍精子頭前部。根據(jù)精子頂體完整和損傷與否，將精子頂體形態(tài)分為4種類型：

1．頂體完整型

2．頂體膨脹型

3．頂體破損型

4．頂體全脫型第72頁/共91頁73五、作業(yè)分析制片染色的質(zhì)量。觀察各種類型精子頂體形態(tài)。統(tǒng)計精子頂體完整率。第73頁/共91頁74實驗十家畜精液的冷凍一、目的和要求通過實驗，了解家畜精液冷凍保存的基本操作和流程，初步掌握家畜精液冷凍和解凍的基本方法。第74頁/共91頁75二、材料和儀器牛和豬的精液樣品、液氮罐、鋁飯盒、燒杯、試管、冰箱、水浴箱、低溫溫度計、顯微鏡、蓋玻片、載玻片等。第75頁/共91頁76三、內(nèi)容和方法（一）牛精液的冷凍

1．冷凍稀釋液的配制

12％蔗糖液75ml

卵黃20ml

甘油5ml

青霉素1000IU/ml

鏈霉素1000IU/ml2．解凍液的配制檸檬酸鈉2.9g

蒸餾水100ml配好后過濾，煮沸消毒。第76頁/共91頁773．精液的稀釋與平衡稀釋前先檢查精液的活率，一般不低于0.7，密度應在8億/ml左右，用與精液同溫的稀釋液作2～5倍稀釋。將稀釋后的精液用棉花包裹放入冰箱內(nèi)緩慢降溫到0～5℃，并保持2～4h。

4．滴凍和保存用吸管吸取平衡后的精液滴于用液氮冷卻到-100℃左右的鋁飯盒的表面（飯盒表面距液氮面2～3cm），制成0.1ml劑量的冷凍顆粒。滴凍要求快速、均勻，滴凍結束應使精液顆粒停留3min，待顆粒由黃變白，即可將飯盒蓋浸入液氮。然后用青霉素瓶或紗布袋收集顆粒，作好標記，投入液氮罐中保存。第77頁/共91頁785．解凍在1ml容量的試管內(nèi)裝入2.9％的檸檬酸鈉解凍液1ml，放入4℃的水浴中，隨后取1～2粒精液投入試管中，立即搖動直至顆粒溶化再取出試管，取樣觀察，凡活率在0.3以上即為合格。第78頁/共91頁79（二）豬精液的冷凍1、冷凍稀釋液和解凍稀釋液的配制第79頁/共91頁801、冷凍稀釋液12%蔗糖溶液75ml氨基乙酸0.5g檸檬酸鈉0.5gTris0.2g卵黃20ml雙重蒸餾水加至100ml甘油最終濃度1%

青、鏈霉素500-1000μg/ml。配制12%蔗糖溶液，并加入氨基乙酸，檸檬酸鈉和Tris后過濾煮沸15分鐘消毒。待涼后按比例加入卵黃、甘油、青、鏈霉素，充分攪拌均勻。配方一第80頁/共91頁812、解凍液：葡萄糖5g雙蒸水100ml檸檬酸鈉0.5g