實(shí)驗(yàn)七等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)第1頁(yè)/共13頁(yè)一、目的要求1.學(xué)習(xí)和掌握?qǐng)A盤電泳技術(shù)2.學(xué)習(xí)和掌握等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)原理和方法

第2頁(yè)/共13頁(yè)二、原理蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，所帶電荷的性質(zhì)與數(shù)量與所處環(huán)境的pH值有關(guān)：環(huán)境pH<pI，帶正電，電場(chǎng)下向陰極移動(dòng)；環(huán)境pH>pI，帶負(fù)電，電場(chǎng)下向陽(yáng)極移動(dòng)；環(huán)境pH=pI，不帶電，電場(chǎng)下不移動(dòng)。有一類兩性電解質(zhì)：它具有依次遞變而又相差不大的等電點(diǎn)，在電場(chǎng)下形成遞變而又連續(xù)的pH梯度，故在電泳介質(zhì)中加入這種物質(zhì)則能造成介質(zhì)pH由酸到堿逐步變化。第3頁(yè)/共13頁(yè)等電聚焦原理：

利用：1)各種蛋白質(zhì)pI不同

2）兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自pI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持介質(zhì)，并在凝膠中加入兩性電解質(zhì)載體，在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度的凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。第4頁(yè)/共13頁(yè)兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。(2)在pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)。(3)分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開。(4)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。第5頁(yè)/共13頁(yè)三、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1）兩性電解質(zhì)2）30％丙烯酰胺溶液3）TEMED4）10％過(guò)硫酸銨溶液5）負(fù)極緩沖液：0.1MNaOH正極緩沖液：0.1M磷酸或硫酸固定液：10％（W/V）三氯乙酸染色液脫色液蛋白質(zhì)等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)電泳儀圓盤電泳槽第6頁(yè)/共13頁(yè)圖聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)第7頁(yè)/共13頁(yè)四、操作方法1.凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配膠表10mL7.5%凝膠的配制試劑名稱 體積(mL) 凝膠貯液 2.5 兩性電解質(zhì)載體 0.5 蒸餾水 6.7510%過(guò)硫酸銨 0.0510%TEMED 0.1 蛋白質(zhì)混合樣品 0.1 混勻后置真空干燥器中抽氣10min

第8頁(yè)/共13頁(yè)（3）將配好的凝膠溶液用細(xì)長(zhǎng)頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3-5mm高。（4）待凝膠聚合2.電泳

將裝有膠的玻管固定到電泳槽上槽的洞中（安裝時(shí)要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏）在上槽中裝入0.1mol/L氫氧化鈉溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸緩沖液。連接到電泳儀，接通電源，調(diào)電壓至160V，聚焦過(guò)夜，至電流降為0，則可關(guān)閉電源。第9頁(yè)/共13頁(yè)3．剝膠

電泳結(jié)束后，取下凝膠管，用蒸餾水洗凈兩端電極液，在凝膠條的正極端作上標(biāo)記。用灌滿水的注射器長(zhǎng)針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)玻管，推針前進(jìn)，同時(shí)注入水，靠水流壓力和潤(rùn)滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開，凝膠條即可流出。4.固定染色

取出凝膠條放在一塊潔凈的玻板上，用尺量出固定前的凝膠條長(zhǎng)度。放入帶蓋試管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脫色液漂洗2次，再染色1h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正極端的距離。第10頁(yè)/共13頁(yè)5.蛋白質(zhì)條帶聚焦位置的計(jì)算

求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正極端的實(shí)際長(zhǎng)度為：蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正極端的距離

固定染色前凝膠條長(zhǎng)度

固定染色后凝膠條長(zhǎng)度

第11頁(yè)/共13頁(yè)6.pH梯度的制作

取已知等電點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白聚焦凝膠條放在玻板上，量出各蛋白條帶至正極端的實(shí)際長(zhǎng)度，以條帶實(shí)際長(zhǎng)度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的pH值為縱坐標(biāo)