工業(yè)微生物NADH的代謝調(diào)控第1頁/共17頁引言

NADH是碳代謝和氮代謝的關(guān)鍵輔因子。借助于基因工程手段直接操縱NADH等輔因子，比改進(jìn)代謝網(wǎng)絡(luò)中若干節(jié)點處的酶活性對碳代謝流的影響更為有效，但在NADH層面上調(diào)控碳代謝流的策略,形成了代謝工程的一個重要分支——輔因子工程，即采用分子生物學(xué)的手段,改造細(xì)胞內(nèi)輔因子的再生途徑,調(diào)控微生物細(xì)胞內(nèi)輔因子的形式和濃度,定向改變和優(yōu)化微生物細(xì)胞代謝功能,實現(xiàn)代謝流最大化、快速化地導(dǎo)向目標(biāo)代謝產(chǎn)物。本文從生化工程和代謝工程兩個方面詳述NADH、NAD+含量及其比率的調(diào)控策略。第2頁/共17頁1NADH生理代謝功能NADH的分子結(jié)構(gòu)式第3頁/共17頁NADH參與的各類代謝活動有300多個第4頁/共17頁NADH生理代謝功能1)調(diào)控能量代謝:NADH通過線粒體內(nèi)的電子傳遞鏈,利用氧作為最終電子受體,產(chǎn)生大量ATP;2)調(diào)節(jié)微生物胞內(nèi)氧化還原狀態(tài):NADH/NAD+比率反映了微生物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài);3)調(diào)控碳代謝流:NADH通過自身或所產(chǎn)生的ATP激活或抑制代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，實現(xiàn)對碳代謝流流向及其通量的調(diào)控;4)調(diào)節(jié)線粒體功能:NADH通過影響線粒體通透性、控制線粒體膜上的電壓依從性陰離子通道和增加線粒體膜電位等途徑改變線粒體活性;5)調(diào)控細(xì)胞生命周期。第5頁/共17頁2基于生化工程的NADH代謝調(diào)控2.1添加外源電子受體調(diào)控NADH代謝2.2添加不同還原態(tài)底物對NADH代謝的調(diào)控2.3NAD+合成前體促進(jìn)胞內(nèi)NAD(H/+)代謝2.4環(huán)境條件對NADH代謝的調(diào)控2.5氧化還原電勢(ORP)的改變對NADH代謝的調(diào)控第6頁/共17頁2.1添加外源電子受體調(diào)控NADH代謝醛、酮、酸、分子氮或硝酸鹽均能作為外源電子受體,加速NADH氧化,維持細(xì)胞處于最佳氧化還原狀態(tài)(NADH/NAD+）比率。在利用異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵己糖生產(chǎn)有機酸的過程中,添加一定的外源電子受體，有效地加速了NAD(P)H代謝速度,降低副產(chǎn)物赤藻糖醇和甘油的積累,顯著加速乳酸菌的生長。第7頁/共17頁2.2添加不同還原態(tài)底物對NADH代謝的調(diào)控碳源根據(jù)其在代謝過程中所產(chǎn)的NADH量不同而分為?1、0和+1氧化態(tài)。美國Rice大學(xué)SanKY研究小組在一定稀釋率的恒化厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),隨著碳源氧化態(tài)的增大,NADH/NAD+比率，從0.51(葡萄糖酸)增加到0.75(葡萄糖)和0.94(山梨醇),導(dǎo)致中心代謝流產(chǎn)物乙醇(消耗2molNADH)對乙酸(不消耗NADH)的比率隨之改變。第8頁/共17頁2.3NAD+合成前體促進(jìn)胞內(nèi)NAD(H/+)代謝

微生物細(xì)胞利用自身合成的或從培養(yǎng)基中吸收的煙酸、煙堿作為前體,在磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的作用下經(jīng)3步反應(yīng)合成NAD+，從而為提高胞內(nèi)NADH和NAD+含量提供了新的思路。光滑球擬酵母發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸過程添加8mg/LNAD+合成前體煙酸,使葡萄糖消耗速度和丙酮酸產(chǎn)量分別增加了48.4%和29%。第9頁/共17頁2.4環(huán)境條件對NADH代謝的調(diào)控微生物細(xì)胞所處的外部環(huán)境條件,如溶氧、溫度的變化導(dǎo)致與之相關(guān)的NADH、ATP合成和消耗,從而使微生物細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝途徑發(fā)生顯著變化。在高溶氧的條件下,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸酶和依賴NADP+的異檸檬酸脫氫酶活性和表達(dá)量明顯上調(diào),而TCA循環(huán)中合成NADH的相關(guān)酶的活性明顯抑制。在高濃度溶氧條件下添加外源電子受體乙醛對細(xì)胞的碳和能量代謝并不產(chǎn)生影響。溫度調(diào)控胞內(nèi)NADH方面,有研究發(fā)現(xiàn)較低的發(fā)酵溫度能維持較高的胞內(nèi)NADH/NAD+水平。第10頁/共17頁2.5氧化還原電勢(ORP)的改變對NADH代謝的調(diào)控氧化還原電位通過影響電子傳遞鏈中具有金屬活性位點的關(guān)鍵酶活性,影響NADH/NAD+比率,進(jìn)而影響微生物代謝途第11頁/共17頁3基于代謝工程的NADH代謝調(diào)控3.1過量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶調(diào)控NADH代謝3.2缺失競爭利用NADH途徑調(diào)控NADH代謝3.3引入外源代謝途徑調(diào)控NADH代謝第12頁/共17頁3.1過量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶調(diào)控NADH代謝在促進(jìn)NAD+合成方面，pncB基因編碼的煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶催化生成煙酸單核苷酸(NAMN)的反應(yīng)是NAD回補途徑中的關(guān)鍵限速步驟。過量表達(dá)pncB基因,導(dǎo)致胞內(nèi)NAD+、NADH和總NAD+分別提高，而NADH/NAD+比率降低。在過量表達(dá)依賴于NAD+的脫氫酶方面，在釀酒酵母中過量表達(dá)編碼胞質(zhì)依賴NAD+的乙醛脫氫酶基因ALD3,實現(xiàn)了NADH高效再生。第13頁/共17頁3.2缺失競爭利用NADH途徑調(diào)控NADH代謝在葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)甘油的過程中，采用了維持1,6-磷酸果糖激酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶活性、削弱與甘油競爭NADH的代謝途徑和加強線粒體基質(zhì)氧化分解速度等策略,以及添加甲酸促進(jìn)胞質(zhì)NADH生成速度,使釀酒酵母生產(chǎn)甘油產(chǎn)率突破理論值。第14頁/共17頁3.3引入外源代謝途徑調(diào)控NADH代謝

調(diào)控胞內(nèi)NADH代謝的另一重要策略是在微生物細(xì)胞內(nèi)引入外源氧化還原代謝相關(guān)酶,改變胞內(nèi)NADH生成或氧化途徑,從而改變NADH/NAD+的比率,實現(xiàn)微生物細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控。胞質(zhì)NADH需通過“穿梭”途徑進(jìn)入線粒體,實現(xiàn)NADH再氧化。如能在胞質(zhì)中表達(dá)形成水的NADH氧化酶,可直接將胞質(zhì)中的NADH氧化為NAD+,提高NADH氧化速度和效率。第15頁/共17頁4結(jié)論與展望將調(diào)控胞內(nèi)NADH/NAD+作為技術(shù)手段以優(yōu)化微生物細(xì)胞生理代謝功能以促進(jìn)微生物合成目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流最大化和快速化或合成新的代謝產(chǎn)物的研究則較其他方法少些。