學(xué)習(xí)情境九微生物的分離純化與保藏技術(shù)第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四微生物純化、分離的原因自然界中，微生物都是以群居的方式存在的在人為條件下培養(yǎng)的微生物群體稱為培養(yǎng)物(culture)只有一種微生物的培養(yǎng)物稱作純培養(yǎng)物(pureculture)第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四純培養(yǎng)的過程通過分離、純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物接種技術(shù)無菌操作技術(shù)第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四一、接種技術(shù)接種工具

接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四無菌技術(shù)(aseptictechnique)在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)，防止其被其它微生物污染的技術(shù)純培養(yǎng)物

環(huán)境第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四二、微生物分離純化技術(shù)分離(isolation)：從混雜微生物群體中獲得只含有某一種微生物的過程稱為微生物分離與純化。用固體培養(yǎng)基分離用液體培養(yǎng)基分離單細(xì)胞分離富集分離第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四1.利用固體培養(yǎng)基分離原理：微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四1.利用固體培養(yǎng)基分離值得指出的是：在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征后才能確定有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到

視頻錄像/programs/view/4GG6NWunN6w/第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四（1）稀釋傾注平板法（pourplatemethod）先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1∶10、1∶100、1∶1000…）然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出出菌落如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四傾注平板第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四（2）涂布平板法（spreadplatemethod）

將含菌的樣品加入還比較燙的瓊脂培養(yǎng)基，再倒平板，易造成某些熱敏感菌的死亡某些好氧菌會(huì)在瓊脂中間缺氧影響生長第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四涂布vs.傾注第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(3)平板劃線分離法（streakplatemethod）

第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四(3)平板劃線分離法（streakplatemethod）連續(xù)稀釋的過程第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四平板劃線分離的方法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四2.用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)稀釋法原理：連續(xù)稀釋，使一只試管里分配不到一個(gè)微生物如果大多數(shù)平行稀釋管里沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物就是純培養(yǎng)物第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四3.單細(xì)胞挑取分離法

第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四4.富集分離法利用選擇培養(yǎng)基創(chuàng)造只讓所需微生物生長的條件，所需微生物有效地與其他微生物競爭，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如分離專性寄生菌，須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群中，使其大量生長。多次重復(fù)移種便可得到純的寄生菌。

第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四附：一些操作技術(shù)圖片培養(yǎng)第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四倒平板第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四isolationplate第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四移接斜面常用的接種方法劃線接種點(diǎn)接種穿刺接種涂布接種液體接種注射接種第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四斜面接種時(shí)的無菌操作(1)接種滅菌(2)開啟棉塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好棉塞第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四純化（平板劃線法）倒平板——?jiǎng)澗€——培養(yǎng)——挑菌落——純種（純培養(yǎng)）

第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四任務(wù)二微生物菌種保藏技術(shù)第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四一、菌種的衰退與復(fù)壯的

1.衰退：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

常見的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

2、菌種的復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來優(yōu)良性狀第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

菌種的復(fù)壯措施：

純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）；

通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）；

淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）；

采用有效的菌種保藏方法。第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

3、防止菌種衰退的方法：

控制傳代次數(shù)（一般在DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯(cuò)配率是5x10-4，自發(fā)突變的頻率為10-8～10-9，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的數(shù)）；

選擇合適的培養(yǎng)條件；

采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代（對絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種）；

采用有效的菌種保藏方法。第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

二、菌種保藏1、目的：

存活，不丟失，不污染；

防止優(yōu)良性狀喪失；

隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種。第34頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四2.原理選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分生孢子、芽胞等）創(chuàng)造降低微生物代謝活動(dòng)強(qiáng)度，生長繁殖受抑制難以發(fā)生突變的環(huán)境條件（其環(huán)境要素是干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)等）添加保護(hù)劑第35頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

3.菌種保藏的方法

菌連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種種生活態(tài)傳代培養(yǎng)保藏法連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在合適的載體上第36頁，共38頁，2023年，2月20日，星期四

方法：

①低溫保藏法：

方法：菌種管置4℃冰箱保藏，定時(shí)傳代。

原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降。

②石蠟油低溫保藏法：

橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。

③干燥保藏法將菌種置于土壤、細(xì)紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時(shí)間