第四章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶TheproductionofEnzymebyCulturingofAnimalorPlantCells概述動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，容易貼壁對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格（血清培養(yǎng)基）對(duì)環(huán)境敏感（pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力）植物細(xì)胞有細(xì)胞壁，但比微生物的細(xì)胞壁脆弱營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，要達(dá)到高密度較困難植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較特征哺乳動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞微生物細(xì)胞大小(m)10～10010～1001～10生長(zhǎng)形式懸浮、貼壁懸浮懸浮營(yíng)養(yǎng)要求很復(fù)雜很復(fù)雜簡(jiǎn)單倍增時(shí)間(h)15～10020～1200.5～5細(xì)胞分化有有限分化無環(huán)境影響非常敏感敏感一般產(chǎn)物存在部位胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物濃度低低高供氧需求(KLa)1～2520～30100～1000產(chǎn)物種類疫苗、單抗、酶、生長(zhǎng)因子、激素等天然色素、天然有機(jī)化合物等抗生素、有機(jī)小分子、酶等本章主要內(nèi)容動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn)植物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動(dòng)物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制從基因到蛋白質(zhì)有關(guān)微生物細(xì)胞中酶合成的調(diào)節(jié)理論也基本適用于動(dòng)植物細(xì)胞動(dòng)植物細(xì)胞具有比微生物更多的調(diào)節(jié)方式轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)翻譯水平調(diào)節(jié)激素、神經(jīng)調(diào)節(jié)第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)基因擴(kuò)增加速酶的合成通過增加基因的數(shù)量調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以發(fā)生在個(gè)體發(fā)育某一階段或細(xì)胞分化某一過程細(xì)胞的一種應(yīng)急方式基因擴(kuò)增可以由選擇壓力引起耐藥性細(xì)胞的抗藥性產(chǎn)生例：CHO細(xì)胞為對(duì)抗氨甲基喋呤對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制，編碼這種酶的基因急劇擴(kuò)增第一節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)

抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成抗體酶（abzyme）：催化性抗體，是具有生物催化功能的抗體分子，是人工改造的對(duì)抗體可變區(qū)賦予催化特性的特殊抗體修飾法在抗體與抗原結(jié)合部位引進(jìn)催化基團(tuán)誘導(dǎo)法（主要方法）半抗原誘導(dǎo)酶蛋白誘導(dǎo)1902年，Haberlandt首次提出分離植物單細(xì)胞并培養(yǎng)成植株的設(shè)想植物細(xì)胞的全能性Haberlandt植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶種類產(chǎn)酶植物細(xì)胞產(chǎn)酶品種胡蘿卜細(xì)胞糖苷酶紫苜蓿細(xì)胞-半乳糖苷酶甜菜細(xì)胞過氧化物酶、酸性/堿性轉(zhuǎn)化酶、糖化酶大豆細(xì)胞過氧化物酶、苯丙氨酸裂合酶花生細(xì)胞苯丙氨酸裂合酶假挪威槭細(xì)胞漆酶利馬豆細(xì)胞-葡萄糖苷酶番木瓜細(xì)胞木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶大蒜細(xì)胞超氧化物歧化酶菠蘿細(xì)胞菠蘿蛋白酶劍麻細(xì)胞劍麻蛋白酶植物細(xì)胞的主要特點(diǎn)體積較大：比動(dòng)物細(xì)胞和微生物細(xì)胞都大細(xì)胞生長(zhǎng)速率和代謝速率低于微生物細(xì)胞，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求較動(dòng)物細(xì)胞簡(jiǎn)單細(xì)胞生長(zhǎng)及合成次級(jí)代謝產(chǎn)物需要光照條件對(duì)剪切力較敏感主要用于產(chǎn)天然產(chǎn)物、色素、香精等有機(jī)物（次級(jí)代謝物）植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)提高目標(biāo)物的產(chǎn)率縮短生產(chǎn)周期木瓜蛋白酶：木瓜生長(zhǎng)期8個(gè)月，木瓜細(xì)胞培養(yǎng)約1個(gè)月易于管理，不受自然因素控制可以提高產(chǎn)物質(zhì)量通過嚴(yán)格的培養(yǎng)條件控制，減少植株病蟲害和污染缺點(diǎn)培養(yǎng)條件要求高——光照、剪切力影響顯著植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢——相對(duì)于微生物植物體外培養(yǎng)胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)——獲取植物細(xì)胞：直接分離法直接分離法即直接從外植體中分離機(jī)械法將外植體搗碎，過濾或離心分離細(xì)胞質(zhì)壁未分離；細(xì)胞破碎率高，完整細(xì)胞數(shù)量少酶解法利用果膠酶、纖維素酶等處理外植體，分離具有代謝活性的細(xì)胞能降解細(xì)胞壁，必須對(duì)細(xì)胞給予滲透壓保護(hù)植物細(xì)胞培養(yǎng)——獲取植物細(xì)胞：愈傷組織誘導(dǎo)法愈傷組織（callus）由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的團(tuán)狀不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞群體；本意是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的可幫助傷口愈合的組織誘導(dǎo)過程配制半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基滅菌、植入外植體1～3周后繼代培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)——獲取植物細(xì)胞：原生質(zhì)體再生法一般采用酶解法分離原生質(zhì)體，使用纖維素酶和果膠酶混合物保持溶液的高滲狀態(tài)防止原生質(zhì)體脹裂滲透壓穩(wěn)定劑：糖、鹽、甘露醇、山梨醇等原生質(zhì)體培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁植物細(xì)胞培養(yǎng)基水：一般用去離子水或蒸餾水無機(jī)成分大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co有機(jī)成分碳源：糖，以蔗糖最常用氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys…）及蛋白水解物、無機(jī)氮維生素：主要是B族維生素和維生素C生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：生長(zhǎng)激素、細(xì)胞分裂素等（微量）其他：肌醇、瓊脂等常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基硝酸鹽濃度較高，營(yíng)養(yǎng)成分適宜，使用范圍廣B5

培養(yǎng)基NH4+

濃度較低，適用于雙子葉木本植物White培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度低，高M(jìn)g(II)、B(III)，適用于生根培養(yǎng)KM-8P培養(yǎng)基有機(jī)成分種類齊全，用于原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)基配制配制母液，使用時(shí)按需要稀釋工藝條件及其控制溫度室溫范圍（25oC左右）最適產(chǎn)酶溫度和最適生長(zhǎng)溫度不同pH微酸性（pH5～6）細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，pH一般變化不大溶解氧植物細(xì)胞需氧量不高，供氧不宜過量對(duì)剪切力敏感，通風(fēng)攪拌不宜太劇烈產(chǎn)酶實(shí)例——大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)SOD超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1）生物體內(nèi)清除超氧化物陰離子自由基（O2·-）的重要金屬酶類SOD和過氧化氫酶(catalase)、過氧化物酶(peroxidase，POD)一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的酶促反應(yīng)防御體系，從而維護(hù)生物體內(nèi)細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng)產(chǎn)酶實(shí)例——大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)SOD大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)選取結(jié)實(shí)、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后無菌水漂洗3次在無菌條件下，切成0.5cm3

的小塊，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固體MS培養(yǎng)基中25oC，600lux，12h/d光照條件下培養(yǎng)18天，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每18天繼代一次動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)動(dòng)物細(xì)胞特性沒有細(xì)胞壁，細(xì)胞脆弱（區(qū)別于植物和微生物）體積比微生物細(xì)胞大幾千倍，但稍小于植物細(xì)胞在肌體內(nèi)相互粘連，以群體形式存在在培養(yǎng)時(shí)具有群體效應(yīng)、貼壁依賴性、接觸抑制性、功能全能性營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜（血清培養(yǎng)基）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)主要用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)生長(zhǎng)緩慢容易受污染（細(xì)菌、支原體），培養(yǎng)過程中需添加抗生素對(duì)剪切力特別敏感（胞外缺少保護(hù)結(jié)構(gòu)）大部分具有貼壁依賴性——貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格高昂細(xì)胞生命有限，一般最多繼代培養(yǎng)50代即退化死亡動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式——懸浮培養(yǎng)適用于非貼壁依賴型細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、體液（血液、淋巴液）細(xì)胞類似于微生物細(xì)胞的深層發(fā)酵，但工藝條件有較大差別對(duì)通氣、攪拌耐受性差對(duì)氧氣的要求較微生物低，培養(yǎng)時(shí)需通入一定比例CO2優(yōu)點(diǎn)（相對(duì)于貼壁培養(yǎng)）細(xì)胞在培養(yǎng)液中均勻分散，生長(zhǎng)情況良好傳代培養(yǎng)容易，無需消化分散細(xì)胞培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分利用率高動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式——貼壁培養(yǎng)適用于貼壁依賴型細(xì)胞上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞細(xì)胞在培養(yǎng)容器表面迅速鋪展并分裂滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但比表面積小微載體培養(yǎng)系統(tǒng)由葡聚糖凝膠等聚合物制得的微球兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均一動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式——固定化培養(yǎng)貼壁或非貼壁依賴型細(xì)胞均適用吸附法載體為多孔性顆粒，如陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒貼壁型細(xì)胞的微載體培養(yǎng)即屬此類包埋法將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中細(xì)胞不易脫落固定化培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞損傷程度低，可重復(fù)使用產(chǎn)物分離容易動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程種質(zhì)細(xì)胞體細(xì)胞（動(dòng)物體內(nèi)組織取出）雜交瘤細(xì)胞基本工藝過程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基氨基酸：各種必需氨基酸，Gln等，作為碳源和能源利用維生素：B族和維C，可由血清提供無機(jī)鹽：調(diào)節(jié)滲透壓微量元素：Fe、Cu、Zn等，可由血清提供葡萄糖：作為碳源和能源（易產(chǎn)生乳酸）激素：胰島素、生長(zhǎng)激素、氫化可的松等，可由血清提供生長(zhǎng)因子：如表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，一般來源于血清培養(yǎng)基配制配制母液，使用前過濾除菌、稀釋；Gln單獨(dú)配制，冷凍保存動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一般控制在36.5±0.25oC溫度也影響CO2

溶解度，從而影響培養(yǎng)液pH值滲透壓保持細(xì)胞內(nèi)外等滲狀態(tài)，一般700～850kPa溶解氧供氧不足：細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制過量供氧：容易產(chǎn)生較多氧自由基，殺傷細(xì)胞用混合氣代替空氣（空氣、O2、N2、CO2）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制pH值與CO2

濃度動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液pH在7.0～7.6之間，以pH7.4為最佳最常用的緩沖體系為CO2/HCO3-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)缺少CO2，培養(yǎng)液中的HCO3-

會(huì)被耗盡；CO2

保持了HCO3-

的濃度，以提供穩(wěn)定的緩沖環(huán)境通常CO2

濃度維持在2～10%之間指示劑：酚紅動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制pH值——HEPES緩沖體系HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonicacidHEPESisazwitterionicorganicchemicalbufferingagent.HEPESiswidelyusedincellculture,largelybecauseitisbetteratmaintainingphysiologicalpHdespitechangesincarbondioxideconcentration(producedbycellularrespiration)whencomparedtobicarbonatebuffers,whicharealsocommonlyusedincellculture.HEPESislikewaterinthatitsdissociationdecreasesasthetemperaturedecreases.ThismakesHEPESamoreeffectivebufferingagentformaintainingenzymestructureandfunctionatlowtemperatures.相關(guān)問題——為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時(shí)傳代傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分離、稀釋并接種到新培養(yǎng)基上繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的階段體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有生長(zhǎng)接觸抑制的特性，也就是說當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時(shí)候，它就會(huì)停止生長(zhǎng)當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿的表面時(shí)，正常的細(xì)胞停止生長(zhǎng)，但是轉(zhuǎn)化（即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的、對(duì)接觸抑制不敏感的細(xì)胞會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)如果不及時(shí)傳代，這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會(huì)逐步取代正常的細(xì)胞，導(dǎo)致正常細(xì)胞的退化?產(chǎn)酶實(shí)例——人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)tPATissueplasminogenactivator(abbr.tPA)isaproteininvolvedinthebreakdownofbloodclots.Itisaserineprotease(EC3.4.21.68)foundonendothelialcells,thecellsthatlinethebloodvessels.Asanenzyme,itcatalyzestheconversionofplasminogentoplasmin,themajorenzymeresponsibleforclotbreakdown.Becauseitworksontheclottingsystem,tPAisusedinclinicalmedicinetotreatonlyembolicorthromboticstroke.Useiscontraindicatedinhemorrhagicstroke andh