本文格式為Word版，下載可任意編輯——法醫(yī)試驗(yàn)室?guī)追N常用DNA提取方法及對(duì)比法醫(yī)試驗(yàn)室?guī)追N常用DNA提取方法及比較

(一)Chelex100法

原理：Chelex100是一種螯合樹(shù)脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成，含有成對(duì)的亞氨基

二乙酸鹽離子，起著螯合基團(tuán)作用，對(duì)多價(jià)金屬離子有極強(qiáng)親和力。在低離子強(qiáng)度、堿性及100℃煮沸條件下，可以使細(xì)胞膜裂解，并使與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)變性，DNA游離。檢材基質(zhì)中一般含有大量金屬離子，在低離子強(qiáng)度及加熱條件下，金屬離子可以輔助脫氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反應(yīng)，所以在提取DNA時(shí)，參與Chelex100，螯合了金屬離子，防止了DNA降解，提高了PCR擴(kuò)增成功率。

方法：剪取適量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、軟組織等等生物檢材，置于

0.5ml離心管內(nèi)，參與適量純水，室溫浸泡，13,000rpm離心5min，上清丟棄，管底留約20μl左右液體及檢材基質(zhì)，參與100-200μl5%Chelex100(有時(shí)需加適量PK)56℃15min至數(shù)10小時(shí)不等，100℃8min，13,000rpm離心5mim，上清備用。

評(píng)述：

1、Chelex100法已經(jīng)成為DNA提取的基本方法，Chelex100法是萬(wàn)能的。目前，我們一切

純化方法都在Chelex100法的基礎(chǔ)上進(jìn)行，Chelex100法又不是萬(wàn)能的。

2、Chelex100法提取前的檢材清洗十分重要，由于現(xiàn)場(chǎng)檢材往往均較臟，臟東西可以抑制

PCR反應(yīng)，所以往往不止清洗一次，清洗檢材時(shí)可能損失部分DNA。所以應(yīng)平衡清洗抑制劑與損失DNA之間的關(guān)系。特別強(qiáng)調(diào)清洗時(shí)應(yīng)“把根留住〞，好多狀況下已知樣本DNA檢驗(yàn)失敗的原因是把根沒(méi)有留住。DNA檢驗(yàn)時(shí)還有另外一句名言：“一個(gè)蘿卜一個(gè)坑〞，防止混亂檢材。肝素抑制PCR反應(yīng)，血紅素抑制PCR反應(yīng)，所以長(zhǎng)時(shí)的浸泡、屢屢清洗往往可能洗除肝素及血紅素。在已知樣本屢屢無(wú)檢驗(yàn)結(jié)果疑為肝素抗凝的狀況下，多洗是檢驗(yàn)成功所必需的。血紅素對(duì)普通Taq酶的抑制作用是明顯的，而目前mtDNA擴(kuò)增一般用普通Taq酶，所以同一樣品除進(jìn)行STR檢驗(yàn)外尚需進(jìn)行mtDNA檢測(cè)時(shí)，盡量去除清白血紅素，顯得尤為重要?，F(xiàn)場(chǎng)提取毛發(fā)或樣本毛發(fā)，用毛根進(jìn)行STR檢驗(yàn)時(shí)，純水清洗也十分重要，假使沒(méi)有清洗清白，毛根DNA本身很少，很易檢出為混合型。由于現(xiàn)場(chǎng)毛發(fā)及樣本毛發(fā)很易粘附另一人成份。毛根清洗的特點(diǎn)為振蕩洗滌，不離心，多換水。

3、清洗后檢材中參與5%Chelex100量視檢材而定。檢材參考參與量

0.5×0.5cm血斑150ul-200ul二步法精斑100ul毛根10ul煙頭30-50ul

4、對(duì)于組織，難溶檢材，有疑問(wèn)檢材，均可參與終濃度為100ug/ml左右PK，有時(shí)間隔一

段時(shí)間，補(bǔ)加適量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最正確pH為8.0。

5、參與Chelex100后，56℃浸泡時(shí)間，血斑≥15min;組織≥30min，二步法精斑≥1h。6、PCR擴(kuò)增前應(yīng)離心。PCR擴(kuò)增時(shí)不應(yīng)吸入Chelex100，由于Chelex100為PCR抑制劑。7、Chelex100使用濃度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人愛(ài)好。配制好5%Chelex100pH

應(yīng)在10—11之間，否則應(yīng)丟棄，不應(yīng)人為調(diào)整Chelex100懸液pH值。

(二)有機(jī)法

原理：有機(jī)法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫飽和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不

同方法提取DNA。DNA易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，蛋白質(zhì)分子表面帶有親水性基因，很簡(jiǎn)單進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能夠順利地進(jìn)入到水溶液中，形成穩(wěn)定的膠體溶液。在有機(jī)溶劑存在的狀況下，破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，使蛋白質(zhì)變性沉淀，離心后，有機(jī)溶劑于試管底層(有機(jī)相)，DNA繼續(xù)穩(wěn)定的存在于上層水相，蛋白質(zhì)沉淀存在于兩相之間。水相中的DNA在大量冷無(wú)水乙醇及單價(jià)陽(yáng)離子存在的狀況下，水會(huì)溶于乙醇中，而DNA從水相中析出，沉淀，通過(guò)離心回收。有機(jī)法中常用試劑為平衡酚、氯仿，酚及氯仿作用是使蛋白質(zhì)變性，氯仿的另一作用是有助于水相與有機(jī)相分開(kāi)，并抽提溶于水中(有時(shí)達(dá)12%)的酚。平衡酚、氯仿及乙醇，三者互溶。

方法：剪取適量檢材，置于0.5ml離心管內(nèi)，清洗方法同用Chelex100法提取DNA，參與適

量純水及終濃度為100μg/mlPK，37℃-56℃孵育15min至數(shù)10小時(shí)，有時(shí)間隔一段時(shí)間補(bǔ)加適量PK→13,000rpm5min→吸上清于另一管→參與等體積平衡酚→振蕩或顛倒完全混勻→13,000rpm5min→吸上清水相于另一管，參與等體積1：1混合平衡酚：氯仿→振蕩或顛倒完全混勻→13,000rpm5min→吸上清水相于另一管→參與等體積氯仿→振蕩或顛倒完全混勻→13,000rpm5min→吸上清水相于另一管→參與2.5倍體積冷無(wú)水乙醇冷凍保存10min以上→13,000rpm5-10min→棄上清→室溫涼干或100℃5min烤干→參與10-20μl純水→室溫溶解或100℃5min幫助溶解→離心上清備用

評(píng)述：

1、有機(jī)法是經(jīng)典DNA提取方法，目前國(guó)內(nèi)外仍大量采用，其提取DNA特點(diǎn)為雙鏈，純度高。2、有機(jī)法缺點(diǎn)是應(yīng)用有毒有機(jī)試劑，對(duì)人體有害，污染環(huán)境；屢屢換管，簡(jiǎn)單引起檢材污染及編號(hào)混亂。有機(jī)法提取DNA的另一個(gè)缺點(diǎn)是不能去除某些染料，血紅素等，而這些恰好是PCR抑制劑。

(三)磁珠法

原理：(異)硫氰酸胍(GuSCN)是猛烈蛋白變性劑，不破壞蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，能破壞細(xì)胞膜

及核膜蛋白，并使核酸酶失活，釋放DNA。磁珠可以特異性吸附DNA，與DNA結(jié)構(gòu)及片段大小無(wú)關(guān)。通過(guò)洗滌液洗滌，在僅留有特異吸附DNA的磁珠中參與洗脫液，65℃解離后，DNA釋放于洗脫液中。

方法：5%Chelex100提取DNA上清液或者用裂解液直接提取骨骼、指甲、毛發(fā)DNA上清液

等約移于0.5ml離心管內(nèi)→參與結(jié)合液100ul，磁珠5ul→振蕩混勻，室溫5min→在磁架上吸棄上清→參與洗滌液I300ul→振蕩混勻→在磁架上吸棄上清→參與洗滌液II300ul→振蕩混勻→在磁架上吸棄上清→參與洗滌液II300ul→室溫放置2min枯燥→參與30-50μl洗脫液，振蕩混勻→65℃10min→速于磁架上吸上清于另一新離心管內(nèi)，備用。

評(píng)述：

1、磁珠法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，不使用有機(jī)溶劑，安全無(wú)毒。且經(jīng)過(guò)筆者驗(yàn)證，磁珠法靈敏度十分高，于一根放置月余的帶毛囊的毛發(fā)中成功提取到DNA且后期的STR分型檢測(cè)中成功檢測(cè)到19個(gè)位點(diǎn)。由此可見(jiàn)，磁珠法十分適用于微量及疑難檢材的DNA提取。

2、磁珠法與離心柱法比較，前者簡(jiǎn)單、便利，轉(zhuǎn)移離心管次數(shù)較少，不易污染，而后者則正好相反。

3、目前磁珠法已被廣泛地用于法醫(yī)DNA試驗(yàn)中，國(guó)內(nèi)的品牌主要有洛陽(yáng)惠爾納米科技有限公司的法醫(yī)樣本DNA試劑盒，該品牌生產(chǎn)的磁珠穩(wěn)定性、靈敏性均居于世界前列，與國(guó)外某些品牌相比提取和純化效果也毫不遜色。

(四)鹽析法

1988年Miller等報(bào)導(dǎo)經(jīng)典鹽析法提取血液DNA，其方法為溶解紅細(xì)胞后，離心沉渣用PK消化，用大約6M飽和NaCl沉淀蛋白質(zhì)，離心上清中DNA用無(wú)水乙醇沉淀，用TE溶解。

(五)NaOH法

原理：強(qiáng)堿溶解、變性蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜及核膜，變性核酸酶，釋放DNA，NaOH不破

壞DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)。

方法：

1、試劑配制裂解buffer0.2MNaOH中和buffer0.04MTris-HCLpH7.52、試驗(yàn)步驟5μl或1×1mm血斑→參與450μl純水→室溫或37℃15-30min→13,000rpm5min→棄上清→沉淀中參與20μl0.2MNaOH（全血室溫5min血斑75℃5min）→參與180μl0.04MTris-HCLpH7.5→振蕩混勻，離心上清備用

評(píng)述：

1、一般認(rèn)為堿性法提取DNA的主要缺點(diǎn)是DNA保存于堿中不穩(wěn)定，4℃放置24h后PCR擴(kuò)增往往失敗。NaOH法提取DNASTR檢測(cè)不穩(wěn)定(4℃保存24h后PCR為陰性)的主要原因是NaOH未完全破壞DNA酶及DNA與蛋白質(zhì)重新結(jié)合。

2、堿性法提取DNA的局限性。煙頭、郵票、口腔擦拭物、精斑、血斑、指甲等均可用堿性法提取，但是毛根、軟組織等不能用NaOH法提取。

(六)五種DNA提取方法的比較

1、Chelex100法及堿性法的優(yōu)點(diǎn)是DNA提取時(shí)間短，單管，檢材不易污染，缺點(diǎn)是提取DNA純度不高。堿性法與Chelex100法比較，前者成本更低，缺點(diǎn)是提取DNA保存時(shí)間短，室溫不超過(guò)7天，4℃及冷凍保存84天后均無(wú)法成功檢見(jiàn)Amel及STR位點(diǎn)。由于堿性法及Chelex100法均便利簡(jiǎn)單，提取DNA時(shí)間短，特別適合于建立DNA罪犯數(shù)據(jù)庫(kù)及已知樣本DNA檢驗(yàn)。2、有機(jī)法及磁珠法優(yōu)點(diǎn)是提取DNA濃、純，特別適合于特別生物檢材，微量疑難生物檢材DNA提取。有機(jī)法缺點(diǎn)是提取過(guò)程繁雜，耗時(shí)，多管，檢材易污染，及有機(jī)試劑污染環(huán)境、傷害人體。磁珠法提取簡(jiǎn)單快捷，安全無(wú)毒，且無(wú)需頻繁移管，檢材污染可能性小，特別適用于微量檢材。而且可協(xié)同工作站進(jìn)行全自動(dòng)操作，大大提高了提取的效率。3、鹽析法的優(yōu)點(diǎn)包括低廉，不用有機(jī)試劑。缺點(diǎn)是不易提取微量檢材。

(七)DNA提取幾種常用試劑作用及濃度

1、PK破壞蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)成碎片，貯存濃度一般為