分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（綜合性）質(zhì)粒DNA的抽提、酶切及電泳鑒定常規(guī)PCR技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞基因組DNA的分離、純化與檢測(cè)1質(zhì)粒DNA的抽提、酶切及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)2實(shí)驗(yàn)安排上午：質(zhì)粒DNA的提取與純化中午：質(zhì)粒DNA的酶切下午：電泳鑒定作為載體的質(zhì)粒：

多克隆位點(diǎn)選擇標(biāo)記容納較大的外源DNA質(zhì)粒的特性：相對(duì)獨(dú)立性獨(dú)立的復(fù)制單位賦予宿主細(xì)胞一些表型與宿主菌染色體DNA不同質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA的目的與意義基因載體/基因克隆/基因工程：在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。如何獲得批量的純化質(zhì)粒DNA分子？（一）載體的制備：質(zhì)粒DNA的提取與純化堿裂解法分離純化質(zhì)粒DNA基本原理：利用質(zhì)粒DNA與染色質(zhì)DNA變性與復(fù)性的差異。

當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性；當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。原理示意圖溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖,（pH8.0）10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HCl溶液Ⅱ：0.2mmol/LNaOH,1%SDS溶液Ⅲ：pH4.8,[K+]=3mol/L,（pH4.8）[Ac-]=5mol/L

重懸細(xì)菌；保護(hù)和緩沖作用裂解細(xì)菌蛋白、DNA變性中和NaOH質(zhì)粒DNA復(fù)性染色質(zhì)DNA、蛋白不能復(fù)性重要試劑1.取1mL菌液于1.5mL離心管中，10000rpm離心1min，棄上清。2.將細(xì)菌沉淀懸浮于100μL冰預(yù)冷的溶液I中，振蕩混勻。3.加200μL新鮮配制的溶液II，蓋緊管蓋，上下輕柔顛倒離心管混勻5次（勿強(qiáng)烈振蕩），冰上放置2min。4.加入150μL預(yù)冷的溶液III，將管輕柔上下顛倒數(shù)次（6-8次）混勻，見白色絮狀沉淀，冰上放置3min。堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟

步驟1中可用移液槍將殘留液體吸取，勿吸到沉淀。步驟2中應(yīng)充分懸浮，使細(xì)胞分散混勻。步驟3、4中切記動(dòng)作輕柔，應(yīng)緩慢上下顛倒離心管混勻，勿強(qiáng)烈振蕩，否則質(zhì)粒容易斷裂。菌液：EcoliJM109菌株(含pUC19-X基因重組質(zhì)粒)5.12000rpm離心5min，小心吸取上清至干凈的1.5mL離心管中。6.加等體積（約450μL）酚:氯仿，混勻，12000rpm離心5min，取上清移至另一1.5mL離心管中。7.加1mL冰預(yù)冷無水乙醇，上下顛倒混勻幾次，室溫放置10min；12000rpm離心5min，棄上清。8.加1mL冰預(yù)冷70%乙醇漂洗沉淀，12000rpm離心5min。9.棄上清，室溫放置5-10min，晾干沉淀。10.加20μL含RNase（無DNase）的TE溶解DNA，37℃水浴消化15-30min以去除RNA。堿裂解法提取質(zhì)粒操作步驟

步驟5、6中吸取上清液時(shí)應(yīng)避免將交界面的蛋白、染色體DNA也吸走。不要讓質(zhì)粒完全干燥，否則將難以溶解。下一步實(shí)驗(yàn)用提取質(zhì)粒后分裝每人最終得到20μL質(zhì)粒DNA，其中10μL用于酶切，5μL用于電泳，其余5μL用于下次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，切記?。?！作好標(biāo)記，放在講臺(tái)上20μL質(zhì)粒5μL質(zhì)粒（凍存）10μL質(zhì)粒（酶切）5μL質(zhì)粒（加入15μLTE）（二）質(zhì)粒DNA的酶切及電泳鑒定

識(shí)別特異的DNA序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。

常用限制性內(nèi)切核酸酶有高度特異的堿基識(shí)別序列和切割點(diǎn)。例如EcoRⅠ的切割位點(diǎn)：５′－G▼AATTC－３′３′－CTTAA▲G－５′

HindⅢ的切割位點(diǎn)：５′－A▼AGCTT

－３′３′－TTCGA▲A－５′限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）本實(shí)驗(yàn)所提取的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒，含有插入的目的片段。如果用EcoRⅠ和HindⅢ同時(shí)切割重組質(zhì)粒（含兩個(gè)單一酶切位點(diǎn)），就產(chǎn)生兩條帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的線性DNA分子。3.4kb2.5kb0.9kbEcoRⅠHindⅢ

質(zhì)粒DNA10μL10×MBuffer2μL

EcoRⅠ1μL

HindⅢ1μLddH2O6μL

21合計(jì)

20μL準(zhǔn)備室老師已將其配成2×限制性酶反應(yīng)混合液

雙酶切體系的建立重組質(zhì)粒的酶切反應(yīng)5μL質(zhì)粒（凍存）5μL質(zhì)粒（加入15μLTE）

酶切反應(yīng)體系

質(zhì)粒DNA10μL2×限制性酶反應(yīng)混合液10μL20μL質(zhì)粒10μL質(zhì)粒（酶切）共計(jì)20μL37℃水浴保溫2-3h2×限制性酶反應(yīng)液包含：10×酶反應(yīng)緩沖液、EcoRI、HindIII核酸電泳核酸分子是兩性解離分子，在pH8.0～pH8.5時(shí)，磷酸全部解離，使得核酸分子帶負(fù)電荷，向電場(chǎng)正極移動(dòng)。

具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段在凝膠中泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小或構(gòu)型來使其分離。重組質(zhì)粒雙酶切電泳酶切質(zhì)粒線狀質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)插入片段線性載體DNA標(biāo)準(zhǔn)（Marker）是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝膠電泳時(shí)，加樣用做對(duì)比來檢測(cè)瓊脂糖凝膠是否有問題以及估算條帶的大小。質(zhì)粒DNA電泳步驟制膠取酶切后的質(zhì)粒DNA溶液20μL、酶切對(duì)照的質(zhì)粒DNA溶液20μL，各加5×上樣緩沖液5μL，混勻后，用移液槍慢慢將混合物加至樣品孔中；另加入5μLDNAMarker至另一樣品孔中。電壓120V，電泳約40min-1h。小結(jié)1．質(zhì)粒的提取：堿裂解法分離純化質(zhì)粒DNA，利用質(zhì)粒DNA與染色質(zhì)DNA變性與復(fù)性的差異。2．質(zhì)粒的酶切：限制性核酸內(nèi)切酶可以識(shí)別特異的DNA序列，并切割雙鏈DNA。本實(shí)驗(yàn)中EcoRI、HindIII將3.4Kb的質(zhì)粒雙酶切為2.5Kb和0.9Kb的兩個(gè)片段。3．電泳分析：利用不同的分子量的DNA片段在瓊脂糖