動(dòng)物源性食品中的抗生素檢測綜述摘要：隨著生產(chǎn)生活水平的提高，各種抗生素在動(dòng)物源性食品生產(chǎn)過程中得到了廣泛的應(yīng)用，但由于抗生素本身的許多副作用，使得抗生素成為動(dòng)物性食品安全的重要問題。本文則通過對一些廣泛應(yīng)用的抗生素的檢測進(jìn)行研究。Abstract：Withtheimprovementofproductionandlivingstandards,avarietyofantibioticsinfoodfromanimalhasbeenwidelyusedinitsproductionprocess,butbecausemanyofthesideeffectsoftheantibioticitself,theimportantissueofantibioticsinanimalfoodsafety.Thisstudyisbythedetectionofsomewidelyusedantibiotics.關(guān)鍵字：抗生素檢測動(dòng)物源性食品Keywords:antibioticdetectionanimaloriginfood正文抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其它活性的一類磁極代謝物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)?，F(xiàn)臨床常用的抗生素有微生物培養(yǎng)液液中提取物以及用化學(xué)方法合成或半合成的化合物。目前在動(dòng)物源性食品中廣泛應(yīng)用的抗生素主要有氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、B-內(nèi)酰胺類抗生素等。一、前言氨基糖苷類抗生素,如鏈霉素、慶大霉素、新霉素、雙氫鏈霉素等,對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都具有顯著的抗菌效果,可以有效抑制細(xì)菌的生長和繁殖,因此是目前我國農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)中常用的獸藥之一,如用于防治魚病、治療細(xì)菌性爛鰓病、赤皮病、腸炎病、白嘴病等,也常添加到飼料中促進(jìn)生長發(fā)育。該類抗生素的主要毒副作用體現(xiàn)為對于腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害,因此,針對該類藥物在食品中的殘留,許多國家和機(jī)構(gòu)都規(guī)定了明確的最大殘留限量(MRLS)。但是由于養(yǎng)殖過程中經(jīng)常存在著違法使用或者不合理使用的現(xiàn)象,食品中氨基糖苷類抗生素的過量殘留,已經(jīng)成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的食品安全問題之一。實(shí)現(xiàn)氨基糖苷類藥殘的有效控制,首先要建立先進(jìn)的檢測方法和技術(shù),并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建合理、高效的檢測體系。我國是動(dòng)物源性食品的生產(chǎn)和出口大國,這方面的研究尤其具有重要的意義。氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)氨基糖苷是一種天然抗生素,品種多達(dá)200余類,其中有使用價(jià)值的品種不下30種,是由2個(gè)或多個(gè)氨基糖以糖苷鍵與氨基醇環(huán)結(jié)合的化合物。氨基糖苷類抗生素的檢測方法氨基糖苷類抗生素沒有特征的紫外吸收,因此微生物效價(jià)法是當(dāng)前各國藥典測定該類抗生素含量的主要方法。目前人們常利用CharmII試驗(yàn)快速檢測和鑒定牛奶、肉、雞蛋中的氨基糖苷類抗生素,牛奶中慶大霉素的檢出限可以達(dá)到0102口g/ml,魚和雞蛋中鏈霉素的檢出限可以達(dá)到0115口g/ml。黃曉蓉等采用阻抗分析法快速檢測牛奶中氨基糖苷類抗生素殘留，用嗜熱乳酸鏈球菌作為指示菌，根據(jù)阻抗儀檢測時(shí)間(DT)的產(chǎn)生,通過“阻抗分析儀”自動(dòng)檢測分析牛奶中氨基糖苷類抗生素的殘留情況。方法操作簡單、快捷,結(jié)果易判斷,全部檢測過程可在2h內(nèi)完成。總的來說,基于微生物的檢測方法所需設(shè)備簡單、價(jià)格低廉,適合于大批樣品的檢測;但是該法存在菌種不易篩選,影響因素復(fù)雜、檢測耗時(shí)長、穩(wěn)定性差、精確度低、靈敏度低的特點(diǎn),往往不能滿足目前實(shí)際檢測工作的要求。1.3免疫法免疫分析法是近年來快速發(fā)展的一種方法,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用范圍廣、操作簡便、快捷、成本低廉及現(xiàn)場適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已開始用于生物樣本中微量抗生素的快速鑒別。根據(jù)對抗原標(biāo)記方法不同,免疫分析法可分為放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析等。放射性免疫法(RIA)是最先發(fā)展的免疫分析方法,并被用于液體中氨基糖苷類抗生素的測定，如秦燕等采用RIA檢測雞肝中鏈霉素殘留，篩選水平為200口g/ml,對雙氫鏈霉素的交叉反應(yīng)率不到1%。但由于具有放射性污染，且后處理困難、費(fèi)用高,RIA目前已較少應(yīng)用。目前已經(jīng)有一些新的免疫分析方法處于研究和發(fā)展之中。如熒光免疫分析(FIA)具有較高的靈敏度，而且容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作;化學(xué)發(fā)光免疫法的靈敏度一般高于其他同位素免疫測定方法;濁度免疫法的精密度較高,專屬性較強(qiáng);利用免疫組織化學(xué)技術(shù)可以研究藥物在體內(nèi)的分布狀況,確定它對其他特殊細(xì)胞的損害作用,如氨基糖苷類抗生素的耳毒性副作用和對腎臟的損傷作用。1.4大型儀器測定法目前檢測氨基糖苷類抗生素的大型儀器方法主要包括:氣相色譜、液相色譜和毛細(xì)管電泳等,這些方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),已經(jīng)成為測定食品中抗生素殘留的重要方法。氣相色譜(GC)氨基糖苷類抗生素為非揮發(fā)性化合物,且在紫外可見光區(qū)無吸收，須先進(jìn)行衍生化，使其適于分析。HOEBUS等用六甲基二硅烷柱前衍生測定大觀霉素,用填充柱氣相色譜法,氫火焰離子化檢測器檢測，在75％~125％的濃度范圍內(nèi)，呈良好的線性，雜質(zhì)的定量限為011%。1.4.2液相色譜(HPLC)檢測氨基糖苷類抗生素大多采用反相色譜或離子對色譜系統(tǒng)。氨基糖苷類抗生素在低pH條件下為極性較強(qiáng)的堿性化合物,因此一般用強(qiáng)離子交換柱進(jìn)行分離,這樣可以進(jìn)一步提高檢測的精確度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。由于氨基糖苷類抗生素沒有特征的紫外吸收,可以利用其結(jié)構(gòu)中的活潑基團(tuán)（如氨基、羰基）與衍生化試劑形成紫外區(qū)有吸收或有熒光的物質(zhì),以便于紫外檢測或熒光檢測,其中又可分為柱前衍生和柱后衍生2種衍生化方法。1.4.3毛細(xì)管電泳（CE）毛細(xì)管電泳是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù),具有分離效率高、速度快、樣品用量少的特點(diǎn)。其中毛細(xì)管區(qū)帶電泳和膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜處理樣品量少,效率高,可以應(yīng)用于生物樣品的分析。FLURER和PHARM利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳直接用紫外檢測法測定了12種氨基糖苷類抗生素及其雜質(zhì)（慶大霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素等）,方法有良好的精密度（RSD=3%），定量限在50口g/ml。但是總體來看目前采用CE檢測氨基糖苷類抗生素的報(bào)道很少,這主要是因?yàn)椴捎脗鹘y(tǒng)的分光光度法檢測的靈敏度很低。5發(fā)展前景及趨勢對于食品中農(nóng)獸藥殘留，以HPLC為代表的色譜技術(shù)已經(jīng)被證明為最為有效的確證性檢測手段之一。針對氨基糖苷類抗生素,伴隨著新型檢測器的出現(xiàn)和應(yīng)用,如電化學(xué)檢測器、示差折光檢測器、脈沖電化學(xué)檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）等,非衍生化HPLC方法的開發(fā)具有非常大的發(fā)展?jié)摿蛯?shí)用價(jià)值。目前及今后較長一段時(shí)間,免疫分析方法仍然是食品中氨基糖苷類抗生素殘留首選的快速檢測方法。隨著單克隆抗體、生物傳感器和膠體金等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展和完善,在進(jìn)一步強(qiáng)化其原有簡便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上,準(zhǔn)確度和精密度的提高將成為重要的研究和開發(fā)目標(biāo),使其不僅適合于生產(chǎn)和流通過程中針對大量樣本進(jìn)行快速篩選檢測,而且在一定條件下具備部分快速確證性檢測的功能,從而與色譜檢測技術(shù)有機(jī)結(jié)合后,構(gòu)建起合理、高效的檢測體系二大環(huán)內(nèi)酯類抗生素MALs大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是由放線桿菌或小單孢菌產(chǎn)生的一類抗生素。近年來。該類藥物被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中。已成為全世界需求量和銷售速度增長最快的抗生素之一。由于MALs具有廣譜抗菌作用，可抵抗革蘭氏陽性菌、支原體菌屬和部分革蘭氏陰性菌，因此被廣泛應(yīng)用于治療豬、牛、羊、蝦及家禽的呼吸性和腸道傳染性疾病，或作為飼料添加劑促進(jìn)動(dòng)物生長發(fā)育。目前已在多種機(jī)體如豬、牛、禽類組織、魚組織、奶和蛋中檢測到MALs的殘留。長期食用殘留該類藥物的食品，可能造成人體腸道細(xì)菌菌群失調(diào)。MALs殘留檢測方法2.1生物學(xué)方法2.1.1微生物效價(jià)法生物效價(jià)法是經(jīng)典的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量測定方法。這種篩選方法簡便、快速、易操作、靈敏度高，但由于該方法固有的局限性（如菌種的差別等），結(jié)果可比性差，方法的檢測限低，達(dá)不到準(zhǔn)確定性定量分析的目的。2.1.2放射受體分析法（RRA）RRA是基于受體與配體的特異性結(jié)合的分析方法，其競爭結(jié)合原理與放射免疫分析相似。應(yīng)用受體的這種特異性可以實(shí)現(xiàn)對某一類抗生素的多殘留分析。目前該方法是我國檢測肉類組織、內(nèi)臟和水產(chǎn)品中MAL殘留的一個(gè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法之一。2.2化學(xué)方法2.2.1薄層色譜法TLC是20世紀(jì)50年代發(fā)展起來的一種色譜技術(shù)，具有操作簡單、應(yīng)用性廣、靈敏度高、快速和檢驗(yàn)成本低的特點(diǎn)，特別適用于無紫外吸收的雜質(zhì)的檢測。我國2000版的《中國藥典》中也使用該方法作為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素物質(zhì)的檢測方法。不過，該方法的分離能力較差，檢測靈敏度較低。毛細(xì)管電泳法CE是20世紀(jì)80年代中后期迅速發(fā)展起來的一類以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離分析技術(shù)，具有高效、樣品及耗溶劑少、成本低。分析快速等優(yōu)點(diǎn)。該方法也逐漸應(yīng)用于MAL的分析當(dāng)中。此法的缺點(diǎn)是檢測靈敏度不夠高，需結(jié)合電化學(xué)或電化學(xué)發(fā)光技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)其高靈敏度檢測。2.2.3液相色譜(LC-DAD或熒光法)由于MALs具有發(fā)光團(tuán)。多數(shù)具有較強(qiáng)的UV吸收。因此可用紫外檢測器(UV)包括二極管陣列檢測器(DAD)對其進(jìn)行檢測。目前該方法已成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室MALs殘留檢測的常用方法。2.2.4液質(zhì)聯(lián)用法(LC—MS/LC—MS/MS法)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是將應(yīng)用范圍極廣的液相色譜分離方法與靈敏、專屬、能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法結(jié)合起來的一門新技術(shù).在國內(nèi)。LC—MS,MS現(xiàn)被應(yīng)用于禽畜肉［ml、蜂蜜和蜂王漿等MALs多殘留同時(shí)檢測當(dāng)中。LC—MS/MS法現(xiàn)在是我國動(dòng)物源性食品中MALs檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。三B-內(nèi)酰胺類牛乳中B-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的原因牛乳中抗生素殘留有三大方面原因:治療目的用藥、非治療目的用藥和非法人為污染。具有B-內(nèi)酰胺環(huán)類的抗生素由于其廉價(jià)廣譜的抗菌性而被廣泛且頻繁地超劑量使用，因此導(dǎo)致牛乳中高濃度的B-內(nèi)酰胺類抗生素殘留。青霉素類抗生素是一類重要的B一內(nèi)酰胺類抗生素，也是使用最廣泛的治療牛乳腺炎和其它乳牛疾病的抗生素，乳牛用藥后，青霉素將不可避免的移行到最初幾天的乳汁中，這一現(xiàn)象稱之為青霉素殘留。B-內(nèi)酰胺類抗生素在牛乳中的殘留危害過敏反應(yīng)若含B-內(nèi)酰胺類抗生素的牛乳被敏感人群飲用，可引起食用者過敏反應(yīng)，表現(xiàn)癥狀輕則皮疹、發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛及胃腸道紊亂引起腹瀉、惡心和嘔吐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生過敏性休克，甚至危及生命。1.2增強(qiáng)細(xì)菌耐藥性美國、德國等國學(xué)者也表明:在乳中含有耐藥菌株，耐藥基因通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移傳染給敏感菌株使其獲得耐藥性。耐藥基因的轉(zhuǎn)移可在人體內(nèi)進(jìn)行，并可在人群、細(xì)菌、動(dòng)物群等生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌間互相傳遞，當(dāng)人體發(fā)生疾病時(shí)，可增加人類和動(dòng)物感染性疾病治療的難度，導(dǎo)致治療失敗，形成惡性循環(huán)。破壞胃腸道菌群失調(diào)在正常條件下健康人與動(dòng)物胃腸道內(nèi)寄生大量菌群，這些菌群與人體能相互適應(yīng)，抗生素殘留會(huì)抑制甚至殺死人體腸道內(nèi)正常敏感菌群的生長，引起服用者體內(nèi)致病菌、條件致病菌大量繁殖，破壞人體腸道菌群平衡。3.2檢測方法最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。紫外檢測器(UVD)最普及，其次是熒光檢測器和電化學(xué)檢測器(ECHD)。3.2.1氣相色譜法(GC)氣相色譜有許多高靈敏、通用性或?qū)Ｒ恍詮?qiáng)的檢測器供選用，如氫火焰離子化檢測器(FID)電子捕獲檢測器(ECD)、氮磷檢測器(NPD)等，檢測限一般為ppb級，但大多數(shù)獸藥極性或沸點(diǎn)偏高，需繁瑣的衍生化步驟，限制了GC的應(yīng)用3.2.2薄層色譜法(TLC)TLC經(jīng)常作為樣品篩選方法，其優(yōu)點(diǎn)是速度快，可以同時(shí)在多快板上點(diǎn)樣，處理大批樣品的時(shí)間短，溶劑用量少，不需要復(fù)雜的儀器也可以開展試驗(yàn)，有利于現(xiàn)場應(yīng)用，但仍需要復(fù)雜的樣品前處理，靈感度不高，不易定量，重現(xiàn)性不好。聯(lián)用技術(shù)聯(lián)用技術(shù)可揚(yáng)長避短，一般兼分離、定量和定性(分子結(jié)構(gòu)信息)于一體，因而特別適用于確證性分析。常見的聯(lián)用技術(shù)有薄層色譜-質(zhì)譜(TLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、毛細(xì)管區(qū)域電泳-質(zhì)譜(CZE-MS)、液相色譜-核磁共振(LC-NMR)、超臨界流體色譜-質(zhì)譜(SFC-MS)等。其它理化檢測方法奶中青霉素殘留檢測方法還有超臨界流體色譜(SFC)和毛細(xì)管區(qū)域電泳法(CZE)等，這些方法盡管在殘留檢測中不常用，但因其各自特有的性能，能彌補(bǔ)常用方法中不足之處。如CZE是90年代以來研究最活躍的分析技術(shù)之一，兼有高壓電泳的高速、高分辨和HPLC靈活、高效的優(yōu)點(diǎn)。免疫分析法。的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結(jié)合為抗原一抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的生化測試技術(shù)。免疫分析法主要有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。ELISA試劑盒是目前奶牛場和牛奶公司使用最廣泛、快速、靈敏的檢測青霉素類抗生素殘留的方法。各類抗生素試劑盒均為國外生產(chǎn)，這使得國內(nèi)的奶及奶制品公司花費(fèi)較大，如國外公司生產(chǎn)的抗生素檢測試劑盒，一個(gè)96次檢測劑盒要花三、四千元。因此很有必要研制和開發(fā)出國產(chǎn)的試劑盒，以降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。四結(jié)束語抗生素殘留問題已成為公認(rèn)的“食品安全隱患”問題，然而動(dòng)物原料及制品是否真正“無抗”則需經(jīng)得起檢驗(yàn)，微生物檢測法經(jīng)濟(jì)簡便，可定性檢測，但檢測時(shí)間長，多用于初級篩選;理化檢測法檢測精度高，可定量檢測，但檢測前處理復(fù)雜，需要大型昂貴儀器，多用于殘留分析的確證;免疫法雖然速度快、特異性強(qiáng)但因受到成本、廣譜性、操作難易程度等多因素影響很難在我國推廣?？梢姡兄瞥鼋?jīng)濟(jì)省時(shí)、簡便易行、靈敏度高、檢測限低的牛乳中抗生素殘留檢測方法已成為迫切的課題。五參考文獻(xiàn)李明遠(yuǎn)．微生物學(xué)與免疫學(xué)．人民衛(wèi)生出版社，2001．鄧斌等．牛奶中抗生素殘留及其檢測分析研究進(jìn)展飼料廣角．2002，24.李明遠(yuǎn)．微生物學(xué)與免疫學(xué)．人民衛(wèi)生出版社，2001．HolstegeDM,PuschnerB,WhiteheadG，GaleyFD,Screeningandmassspectralconfirmationofbeta—lactamantibioticresiduesinmilkusingLC／MS,Journalofagriculturalandfoodchemistry50(2：)406—411JAN162002TANAKAN,HOOPERIR.Aminoglycosideantibiotics[M].Ber2lin:Springer2Verlag,1982:221.王春奕.雞和雞蛋中抗菌素殘留的檢測[J].中國家禽,1997,11(3):16-17.吳燕,郭成明,袁雯瑋.氨基糖苷類抗生素分析方法進(jìn)展[J].天津藥學(xué),2005,17(1):46-48.王敏，郭德華顧鳴。等．動(dòng)物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的快速篩選方法J]中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007,17(3)：400—406.于慧娟。沈小盛，李慶．高效液相色譜法一熒光法測定對蝦組織中紅霉素的殘留量[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2006,25(4):82-85.林敬平.國內(nèi)孚L品抗生素殘留值得重姻〕.當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)2。5(3):1.IvetaKukurova,BeanadetaHozova.InteractionsofAntimicrobialsinMilkandTheirDetetionbytheDiffusionMethodandDelvotestSP.JournalofA0ACInternational.2003,