第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)方法及應(yīng)用實(shí)例一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法二、植物細(xì)胞培養(yǎng)方法三、細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器四、細(xì)胞工程應(yīng)用實(shí)例Celldevelopmentmethodandit’sappliedsolidexample一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)及固定化培養(yǎng)等三種方法。1.貼壁培養(yǎng)所謂貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面（如：培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等）進(jìn)行的培養(yǎng)。⑴生長(zhǎng)特性

貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開(kāi)始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。⑵主要優(yōu)點(diǎn)

細(xì)胞緊密黏附于固相表面，易更換培養(yǎng)液；易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的；因細(xì)胞固定表面，不需過(guò)濾系統(tǒng)；適用于所有類型細(xì)胞。

⑶主要缺點(diǎn)

與懸浮培養(yǎng)法相比：擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；占地面積大；不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。⑷細(xì)胞貼壁的表面

要求具有凈陽(yáng)電荷和高度表面活性。對(duì)微載體而言還要求具一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽(yáng)電荷。3.固定化培養(yǎng)所謂固定化培養(yǎng)是指，將動(dòng)物細(xì)胞與不溶性載體結(jié)合起來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)的方法。簡(jiǎn)單地，說(shuō)就是將被培養(yǎng)生物體固定在一定的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程。動(dòng)物細(xì)胞的固定化易于細(xì)胞與產(chǎn)物的分離及產(chǎn)品的純化。因此，固定化是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞高密度長(zhǎng)期培養(yǎng)、從而提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)效率的重要技術(shù)途徑。常見(jiàn)的固定化方法有：吸附法、共價(jià)貼附法、交聯(lián)法和包埋法等。⑴吸附法所謂吸附法是指：用固體吸附劑將動(dòng)物細(xì)胞吸附在其表面，從而使細(xì)胞固定化。吸附法的主要優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)便、條件溫和；其主要缺點(diǎn)是：載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落。⑵共價(jià)貼附法所謂共價(jià)貼附法是指：利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固體載體結(jié)合的細(xì)胞固定化方法。共價(jià)貼附法連接鍵非常牢固，能有效地減少細(xì)胞泄漏；因化學(xué)試劑的引入，對(duì)細(xì)胞的活性有一定的影響。⑶交聯(lián)法使用雙功能或多功能試劑，直接與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)如氨基、羧基等進(jìn)行交聯(lián)，形成共價(jià)鍵來(lái)固定細(xì)胞，其結(jié)合力是共價(jià)鍵。此法制備的細(xì)胞與載體結(jié)合緊密，但制備麻煩，活力損失較大。包埋就是將細(xì)胞包裹在有限空間內(nèi)，制成固定化細(xì)胞。包埋后的細(xì)胞不會(huì)擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中去，而底物和產(chǎn)物卻能自由擴(kuò)散。包埋法僅只是將細(xì)胞包埋起來(lái)，不與載體發(fā)生反應(yīng)，故包埋法細(xì)胞的活性損失較小。包埋法根據(jù)其包埋的形式不同，又可將其分為格子型和微膠囊型兩種。⑷包埋法二、植物細(xì)胞培養(yǎng)方法常見(jiàn)的植物組織細(xì)胞培養(yǎng)有愈傷組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)等方法。1.愈傷組織培養(yǎng)所謂愈傷組織培養(yǎng)是指，將外植體接種到人工培養(yǎng)基上，在激素作用下，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和分化的培養(yǎng)過(guò)程。植物組織(消毒)MS培養(yǎng)基愈傷組織切取接種培養(yǎng)什么是愈傷組織？長(zhǎng)出莖、葉生根培養(yǎng)試管苗2.原生質(zhì)體培養(yǎng)取植株的幼胚、根、莖或葉等組織細(xì)胞，用纖維素酶或果膠酶除去植物體細(xì)胞的細(xì)胞壁（原生質(zhì)體），在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)分裂，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)分化長(zhǎng)出莖、葉，再長(zhǎng)出根形成植株。植物細(xì)胞愈傷組織長(zhǎng)出莖、葉生根培養(yǎng)馴化移栽原生質(zhì)體分離破壁接種、培養(yǎng)分化培養(yǎng)生根試管苗3.花粉培養(yǎng)在無(wú)菌條件下取出花藥或花粉粒（小孢子），置于培養(yǎng)基上進(jìn)行人工培養(yǎng)，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株。接種花藥花粉愈傷組織單倍植株花粉植株三、細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器種類繁多，根據(jù)細(xì)胞的培養(yǎng)方式不同，可將其分為懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器、貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器及固定化培養(yǎng)反應(yīng)設(shè)備等。1.懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器——攪拌式反應(yīng)器常見(jiàn)的懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器如：攪拌式反應(yīng)器、液體循環(huán)式反應(yīng)器和鼓泡式反應(yīng)器等類型，其工作原理與相應(yīng)的微生物反應(yīng)器（發(fā)酵罐）相同。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞，因沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)，對(duì)攪拌剪切作用十分敏感，直接的機(jī)械攪拌很容易對(duì)其造成損害。同樣，植物細(xì)胞的纖維素細(xì)胞壁雖然使細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗張強(qiáng)度，卻使其抗剪切的能力相當(dāng)弱。因此，傳統(tǒng)用于微生物的攪拌反應(yīng)器用作細(xì)胞的培養(yǎng)，須對(duì)攪拌方式加以改進(jìn)。5L細(xì)胞培養(yǎng)罐中空纖維反應(yīng)器因其剪力小被廣泛運(yùn)用于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。中空纖維反應(yīng)器主要由中空纖維管組成，中空纖維管的內(nèi)徑為200μm，壁厚為50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透過(guò)膜擴(kuò)散，動(dòng)物細(xì)胞貼附在中空纖維管外壁生長(zhǎng)，可以很方便地獲取氧氣。封閉式中空纖維反應(yīng)器循環(huán)系統(tǒng)2.貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器——中空纖維反應(yīng)器常見(jiàn)的貼壁培養(yǎng)反應(yīng)器如：中空纖維反應(yīng)器、玻璃珠床反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器等類型。3.固定化細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備細(xì)胞到生長(zhǎng)后期，其生長(zhǎng)速度降低，有利于細(xì)胞分化及次級(jí)代謝產(chǎn)物積累，則需對(duì)其進(jìn)行固定化培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)有利于細(xì)胞組織化，易獲得高密度細(xì)胞群體，易于控制培養(yǎng)條件及獲得代謝產(chǎn)物。⑴平床細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)平床培養(yǎng)又稱為平板培養(yǎng)，該系統(tǒng)是由培養(yǎng)床、儲(chǔ)液罐和蠕動(dòng)泵等部件構(gòu)成。平床培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖蠕動(dòng)泵培養(yǎng)床進(jìn)液管儲(chǔ)液罐將新鮮細(xì)胞固定在由聚丙烯材料編織成的無(wú)菌平墊（床）上，通過(guò)儲(chǔ)液罐下方管道滴注培養(yǎng)液。培養(yǎng)床上的培養(yǎng)液再經(jīng)過(guò)蠕動(dòng)泵循環(huán)送回儲(chǔ)液罐中。平床細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)設(shè)備較簡(jiǎn)單，比懸浮細(xì)胞培養(yǎng)能更有效地合成次級(jí)代謝產(chǎn)物。⑵立柱細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)立柱培養(yǎng)系統(tǒng)同樣是由培養(yǎng)床、儲(chǔ)液罐和蠕動(dòng)泵等部件構(gòu)成。立柱培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖蠕動(dòng)泵培養(yǎng)床進(jìn)液管儲(chǔ)液罐立柱式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要用于植物細(xì)胞培養(yǎng)。該培養(yǎng)系統(tǒng)是將植物細(xì)胞與瓊脂或褐藻酸鈉混合，制成2－3cm3的細(xì)胞團(tuán)塊，并將其集中于無(wú)菌立柱中。這樣，由儲(chǔ)液罐滴注的培養(yǎng)液流經(jīng)大部分細(xì)胞——“滴液區(qū)”比例與平床培養(yǎng)系統(tǒng)相比，將大大提高。四、動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用實(shí)例20世紀(jì)60年代為了滿足生產(chǎn)疫苗的需要，開(kāi)始運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。后來(lái)隨著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的逐漸成熟和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)利用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)大分子藥用蛋白質(zhì)比原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)越性。1.甲型H1N1流感疫苗的生產(chǎn)甲型H1N1流感病毒與其它季節(jié)性流感病毒不同，該病毒毒株包含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片段。人群對(duì)甲型H1N1流感病毒普遍易感，并可以人傳染人。⑴甲型H1N1流感病毒⑵甲型H1N1流感疫苗的生產(chǎn)流程原始種子（基因重組病毒株）病毒接種增殖培養(yǎng)生產(chǎn)用病毒種子生產(chǎn)前準(zhǔn)備病毒接種病毒培養(yǎng)病毒液病毒滅活液病毒滅活病毒純化液濃縮純化配比分包疫苗產(chǎn)品病毒培養(yǎng)①原始種子——基因重組病毒株世衛(wèi)組織提供的6支甲型H1N1流感原始毒株當(dāng)兩種有親緣關(guān)系的不同病毒感染同一宿主細(xì)胞時(shí)，它們的遺傳物質(zhì)發(fā)生交換，結(jié)果產(chǎn)生不同于親代的可遺傳的子代，稱為基因重組?；蛑亟M病毒有“活病毒基因重組”、“滅活病毒基因重組”及“死活病毒基因重組”。重組病毒株原始種子屬于死活病毒間的重組?；蛑亟M病毒株原始種子保留了病毒的抗原性和復(fù)制能力，降低了病毒的致病力（由世衛(wèi)組織提供）。因?yàn)槭佬l(wèi)組織提供的基因重組病毒株量較少，不足以進(jìn)行批量生產(chǎn)疫苗，必須對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，制備病毒種子批。例如：將能在雞胚中生長(zhǎng)良好的甲型流感病毒（A0或A1亞型）疫苗株經(jīng)紫外線滅活后，再加亞洲甲型（A2亞型）活流感病毒一同培養(yǎng)，產(chǎn)生出具有前者特點(diǎn)的A2亞型流感病毒，可供制作疫苗?！窘臃N、培養(yǎng)】

將稀釋后的病毒種入選擇的雞胚尿囊腔中，隨后將雞胚放入密閉、無(wú)菌、恒溫的孵化箱中繁殖病毒。最后從雞胚尿囊腔里中液體中得到疫苗生產(chǎn)用的種子。③病毒培養(yǎng)原始種子病毒培養(yǎng)生產(chǎn)用病毒種子生產(chǎn)前準(zhǔn)備病毒接種（雞胚）病毒液將得到的生產(chǎn)用病毒種子接種到無(wú)菌雞胚中進(jìn)行培養(yǎng)，得到病毒液。清洗消毒接種病毒滅活滅活試驗(yàn)及其它檢驗(yàn)滅活劑(HC－H)病毒滅活液世衛(wèi)組織提供給疫苗生產(chǎn)廠家的毒種盡管感染性很低，但由于仍然是活的病毒，所以還需要對(duì)生產(chǎn)出來(lái)的病毒進(jìn)行滅活處理以去除病毒的致病力。通過(guò)往病毒收獲液中加入滅活劑（如：甲醛），破壞病毒外殼的酯類成分，使其喪失感染正常細(xì)胞的能力。④病毒滅活病毒液病毒收獲機(jī)

在進(jìn)入下一工序前，須對(duì)病毒滅活液進(jìn)行滅活試驗(yàn)，確保疫苗已經(jīng)滅活——得到病毒滅活液。O2－8℃7～10D抗體是由B淋巴細(xì)胞分化形成的漿細(xì)胞合成、分泌的。每一個(gè)B淋巴細(xì)胞在成熟的過(guò)程中通過(guò)隨機(jī)重排只產(chǎn)生識(shí)別一個(gè)抗原的抗原受體基因。動(dòng)物脾臟有上百萬(wàn)種不同的B淋巴細(xì)胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）和記憶B細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。如果能選出一個(gè)制造一種專一抗體的漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群——單克隆。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體。單克隆抗體是由一種類型的細(xì)胞制造出來(lái)的抗體。漿細(xì)胞2.HBsAg單克隆抗體的生產(chǎn)⑴單克隆抗體①單克隆抗體要制備單克隆抗體，首先需獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細(xì)胞，但這種B淋巴細(xì)胞不能在體外生長(zhǎng)。②單克隆抗體技術(shù)的基本原理B細(xì)胞HGPRT+HGPRT骨髓瘤細(xì)胞融合(HAT)培養(yǎng)基HGPRT+HGPRT存活的雜交瘤長(zhǎng)期體外培養(yǎng)死亡有氨基蝶呤死亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞可在體外生長(zhǎng)繁殖，應(yīng)用細(xì)胞雜交技術(shù)使骨髓瘤細(xì)胞與免疫的淋巴細(xì)胞二者合二為一，得到雜種的骨髓瘤細(xì)胞。這種雜種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，既具有B淋巴細(xì)胞合成專一抗體的特性，又有骨髓瘤細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖永存的特性，用這種來(lái)源于單個(gè)融合細(xì)胞培養(yǎng)增殖的細(xì)胞群，可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。HGPRT：次黃嘌呤－鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶HAT：次黃嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶②免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞的制備健康大鼠(處死)洗滌脾臟抽取細(xì)胞液離心分離免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞（備用）細(xì)胞懸浮液沉淀物DMEM培養(yǎng)液紅細(xì)胞磷酸緩沖液【洗滌】在冰浴下輕輕洗去脾上的紅血球。【抽取細(xì)胞液】

用鑷子輕輕擠壓脾，做成脾細(xì)胞懸液，用毛細(xì)管將懸液移入小試管中。【離心分離】直立小試管3min，使結(jié)締組織下沉；然后將細(xì)胞懸液移入離心管中進(jìn)行離心分離。③待融合用大鼠骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備接種(DMEM培養(yǎng)液）培養(yǎng)(37℃，15-20h）大鼠骨髓瘤細(xì)胞(IR983F細(xì)胞)制成懸浮液離心沉淀制成懸浮液DMEM培養(yǎng)液待融合用大鼠骨髓瘤細(xì)胞(備用)親本IR983F細(xì)胞一般由有關(guān)單位提供通過(guò)融合前的準(zhǔn)備工作，得到了免疫大鼠脾淋巴細(xì)胞和待融合用大鼠骨髓瘤（親本）細(xì)胞后，可對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞融合。免疫大鼠淋巴細(xì)胞大鼠骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合融合混合物層析層析液超濾、濃縮濃縮液凍干抗HBsAg單克隆抗體（精品）⑤濃縮純化雜交細(xì)胞混合物④細(xì)胞培養(yǎng)孔板培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)融合混合物細(xì)胞篩選抗HBsAg單克隆抗體培養(yǎng)液3.迷迭香抗氧化劑的生產(chǎn)⑴迷迭香及其重要成分迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、被子植物門、雙子葉植物綱、唇形目、唇形科、迷迭香屬灌木植物。迷迭香中含有迷迭香精油及抗氧化劑，其抗氧化成分主要為鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等。Rosmarinusofficinalis①迷迭香②迷迭香精油（ROSEMARY）迷迭香精油中主要含有α－蒎烯、1，8桉葉素、莰烯、樟腦、龍腦和β－蒎烯等成分?！局饕πА棵缘憔途哂休^強(qiáng)的皮膚收斂作用，調(diào)理油膩不潔的肌膚，促進(jìn)血液循環(huán)，刺激毛發(fā)再生；具有強(qiáng)心劑、降血壓、調(diào)理貧血作用；具有提神、醒腦、恢復(fù)中樞神經(jīng)活力；具有改善感冒、氣喘、慢性支氣管炎與流感作用；具有增強(qiáng)消化功能，改善結(jié)腸炎、消化不良、脹氣和胃疼等功效。③迷迭香酸（Rosmarinicacid）迷迭香酸具有很強(qiáng)的抗氧化性，其抗氧化活力強(qiáng)于維生素E。迷迭香酸有助于防止自由基造成的細(xì)胞受損，降低癌癥和動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)。也被用于食品防腐?！局饕πА靠寡趸⒀泳徦ダ?；強(qiáng)減肥降脂功效；治療心血管病及抗癌④鼠尾草酸（Carnosicacid）鼠尾草酸具有較強(qiáng)的油溶性成分抗氧化性。在調(diào)味醬、寵物食品和飼料中使用，有助于防止自由基造成的細(xì)胞受損，降低癌癥和動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)的主要?！局饕πА靠寡趸⒀泳徦ダ?；強(qiáng)減肥降脂功效；治療心血管病及抗癌迷迭香抗氧化劑提取物⑵迷迭香抗氧化劑的生產(chǎn)流程迷迭香頂芽扦插繁殖移栽油水分離水蒸氣蒸餾枝葉餾分減壓蒸餾油層迷迭香精油渣晾干粉碎抗氧化劑提取原料過(guò)濾液迷迭香抗氧化劑原料浸提95％C2H5OH浸提液過(guò)濾減壓濃縮回收溶劑懸液水萃取正丁醇減壓濃縮有機(jī)相回收萃取劑膏狀物(D1O1大孔吸附樹(shù)脂)柱分離脫洗結(jié)晶干燥70％C2H5OH4.紫杉醇的生產(chǎn)⑴紫杉醇紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和