酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第1頁

復雜生物體系中生命物質化學測量是揭示生命奧秘主要伎倆，在食品檢驗、疾病診療和預防過程中也日益凸現(xiàn)其主要作用。

經(jīng)典化學分析方法（滴定分析、重量分析、簡單吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象常量或微量分析，面對生物體系成份復雜且待測物濃度較低測試條件則往往無能為力。

于是，一系列針對生物體系中化學成份測量方法應運而生。免疫化學分析即其主要組員，它將免疫學知識與化學分析伎倆有機結合，為生命體系中高特異性、超微量分析提供了處理方法。酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第2頁

什么是酶聯(lián)免疫分析技術

ELISA基礎原理和方法ELISA種類和改變ELISA特點

ELISA應用實例酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第3頁

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA現(xiàn)在已成為當前分析化學領域中前沿課題，它是一個特殊試劑分析方法，是在免疫酶技術(immunoenzymatictechniques)基礎上發(fā)展起來一個新型免疫測定技術。

酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第4頁一、基礎原理它采取抗原與抗體特異反應將待測物與酶連接，然后經(jīng)過酶與底物產(chǎn)生顏色反應，用于定量測定。測定對象能夠是抗體也能夠是抗原。在這種測定方法中有3種必要試劑：①固相抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標識抗原或抗體（標識物）③酶作用底物（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第5頁

測量時，抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一個抗體（抗原）與酶結合成偶聯(lián)物（標識物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當偶聯(lián)物與固相載體上抗原（抗體）反應結合后，再加上酶對應底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第6頁

其所生成顏色深淺與欲測抗原（抗體）含量成正比。

這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也能夠用分光光度計（酶標儀）加以測定。

其方法簡單，方便訊速，特異性強。酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第7頁二、酶及其底物酶結合物是酶與抗體或抗原,半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結產(chǎn)物。是ELISA成敗關鍵試劑，它不但含有抗體抗原特異免疫反應，還含有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不一樣酶選取不一樣底物，將得到不一樣顏色反應.酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第8頁酶底物顯色反應

測定波長

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420

酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第9頁ELISA種類和改變

（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法（四）雙位點一步法（五）捕捉法測IgM抗體（六）應用親和素和生物素ELISA

酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第10頁（一）雙抗體夾心法此法適合用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第11頁取得待分析物未標定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體洗滌除去未結合抗體及雜質加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留蛋白結合位點洗滌并除去未結合封閉蛋白加受檢標本（抗原）形成固相抗體－抗原復合物洗滌除去其它未結合物質加酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標識抗體復合物徹底洗滌未結合酶標抗體加底物進行酶催化反應依據(jù)顏色反應程度進行該抗原定性或定量測定酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第12頁

間接法是檢測抗體最常見方法，其原理為利用酶標識抗抗體以檢測已與固相結合受檢抗體，故稱為間接法。（二）間接法酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第13頁包被固相載體:用已知抗原包被固相載體加待檢標本:使對應抗體與固相抗原結合洗滌，除去無關物質加酶標抗抗體:與固相載體上抗原抗體復合物結合；洗滌，除去未結合酶標抗抗體加底物顯色依據(jù)顏色反應程度進行該抗原定性或定量測定酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第14頁（三）競爭法

此法可用于抗原和半抗原定量測定，也可用于測定抗體。酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第15頁用已知特異性抗體包被固相載體測定管加待測抗原和一定量酶標抗原使二者與固相抗體競爭結合對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合分別洗滌除去未結合成份加底物顯色分別測定兩管吸光度值，依據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，計算標本中待測抗原含量酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第16頁

對照管因為只加酶標抗原，與固相抗體充分結合，故分解底物顯色深；測定管顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合結果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合，使固相上結合酶標抗原量降低。所以，加入底物后顯色反應較弱。酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第17頁特點一：靈敏性該測定法靈敏度來自作為匯報集團酶。眾所周知,酶是一個有機催化劑，極少許酶即可誘導大量催化反應，產(chǎn)生可供觀察顯色反應現(xiàn)象。所以該體系常被稱為酶放大致系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。比如，在測定血清中某一物質含量時，化學比色法敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法敏感度約為5~10μg/ml。

酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第18頁特點二：特異性其特異性來自抗體或抗原選擇性?？乖贵w結合實質上只發(fā)生在抗原抗原決定簇與抗體抗原結合位點之間。因為二者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應含有高度特異性。

酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第19頁

比如乙肝病毒中表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和關鍵抗體（HBcAg），雖起源于同一病毒，但僅與其對應抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應這種特異性使免疫測定能在一非常復雜蛋白質化合物（比如血清）中測定某一特定物質，而不需先分離待檢物。酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第20頁ELISA應用實例酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第21頁

飼料中鹽酸克倫特羅測定飼料中毒素測定（主要包含黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中應用ELISA用于農(nóng)藥殘留檢測酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第22頁河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類比如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor）、西維因（Carbaryl）、多菌靈及克菌丹（Captan）等。農(nóng)藥檢測：酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第23頁ELISA檢測“非經(jīng)典肺炎”冠狀病毒ELISA在結締組織病早期診療中應用檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風濕性關節(jié)炎（PtA）33抗體ELISA在疾病診療中作用ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第24頁ELISA試劑盒商業(yè)資訊酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第25頁ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第26頁酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第27頁酶聯(lián)免疫井酶聯(lián)免疫吸附測定法elisa法第28頁DNM-9602G酶標分析儀DNM-