認(rèn)識(shí)雄性小鼠睪丸、附睪、輸精管等生殖器官結(jié)構(gòu)及位置特點(diǎn)；掌握小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集方法；掌握血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)能力檢驗(yàn)方法；經(jīng)過睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)，認(rèn)識(shí)精子在睪丸產(chǎn)生后，在附睪內(nèi)成熟過程；試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第1頁(yè)5.掌握精子抹片方法；6.掌握染色法進(jìn)行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體結(jié)構(gòu)觀察方法，認(rèn)識(shí)精子正常結(jié)構(gòu)；7.使學(xué)生得到小鼠精子操作基礎(chǔ)訓(xùn)練。試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第2頁(yè)

哺乳動(dòng)物精子在睪丸內(nèi)形成，并必須經(jīng)過在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面改變而最終到達(dá)成熟，才能取得向前運(yùn)動(dòng)能力，這種向前運(yùn)動(dòng)能力取得是精子受精能力主要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物精子包含頭部和尾部?jī)蓚€(gè)主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成頭部和尾部連接。精子頭部主要由核組成，

試驗(yàn)原理小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第3頁(yè)

頭部頂端是頂體，頂體包圍核前端形成帽狀。精子頸部變細(xì)并形成頭部和尾部連接。尾部是精子運(yùn)動(dòng)器官，能夠分為中段、主段和末端。

試驗(yàn)原理小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第4頁(yè)1.設(shè)備與器材：實(shí)體顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、注射器、注射針頭、吸管、試管架、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、剪刀、解剖刀、解剖鑷、載玻片、蓋玻片等。試驗(yàn)用具2.藥品、試劑：

精子操作液（CZB液或KSOM液）、0.5%龍膽紫酒精液、36%甲醛溶液、磷酸緩沖液（PH6.8）、精子固定液（福爾馬林磷酸鹽緩沖液）、吉姆薩工作液。小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第5頁(yè)試驗(yàn)用具3.試驗(yàn)動(dòng)物：

選擇60日齡以上，體重到達(dá)32-35g昆明種公鼠。小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第6頁(yè)1.精子采集：

左手捏小鼠尾部，右手持鑷子，或以圖3-1所表示方法，以頸部脫臼法處死小鼠。使處死小鼠仰臥，用75%酒精棉球消毒腹部開口部位被毛及皮膚。剪開腹壁，暴露生殖系統(tǒng)。無(wú)菌分離睪丸、附睪及輸精管。在含培養(yǎng)液表面皿中，用眼科剪除去睪丸、附睪及輸精管周圍系膜及脂肪，并沖洗潔凈，以免血液或脂肪球混入液體妨礙精子觀察。試驗(yàn)方法小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第7頁(yè)將分離并清洗潔凈睪丸、附睪及輸精管，用眼科剪再分離為睪丸、附睪尾及附帶小段輸精管、其余部分輸精管3部分，棄去附睪頭。采集睪丸精子時(shí)，將睪丸橫切為如干段或組織塊，放在表面皿中，加1ml培養(yǎng)液，用眼科剪輕輕擠壓睪丸組織塊，把精子擠入培養(yǎng)液中，去掉組織塊。置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育20min，使精子自行散開。試驗(yàn)方法小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第8頁(yè)試驗(yàn)方法采集附睪尾精子時(shí)，將其剪成幾段。采集輸精管精子時(shí)，因?yàn)樾∈筝斁芊浅＜?xì)，不能直接沖洗管腔，將輸精管放入含有1ml培養(yǎng)液表面皿內(nèi)，在實(shí)體顯微鏡下，用一只眼科異物針固定輸精管，用另一支異物針向相反方向縱向撕開輸精管，精子會(huì)浮游到培養(yǎng)液中。將大塊輸精管組織撥開，用吸管連同精子吸出液體部分，裝于2ml具塞試管中暫存。小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第9頁(yè)2.精子運(yùn)動(dòng)能力檢驗(yàn)：

用滴管吸收精液，放于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室與蓋玻片接觸處，使精液自然流入計(jì)數(shù)室中。計(jì)數(shù)中間5個(gè)中方格（對(duì)角5個(gè)或四角及中間）內(nèi)80個(gè)小方格精子數(shù)，計(jì)數(shù)值為X0計(jì)算時(shí)，先計(jì)數(shù)死精子X1值，然后計(jì)數(shù)板置于50℃水浴鍋中搪瓷盤中，在50℃條件下5～10min殺死精子，計(jì)數(shù)總精子數(shù)X2值，（X2－X1）/X2為表示精子運(yùn)動(dòng)能力精子活力值。計(jì)數(shù)時(shí)每份精子用3個(gè)計(jì)數(shù)板重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值。試驗(yàn)方法小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第10頁(yè)3.精子整體結(jié)構(gòu)觀察：

取1小滴保留精液在載玻片上，將樣品滴以拉形式制成抹片。用0.5%龍膽紫酒精液染色3min，自然干燥，水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數(shù)為結(jié)構(gòu)正常精子，部分為畸形精子，如頭部畸形（如頭部巨大、瘦小、細(xì)長(zhǎng)、圓形、輪廓不顯著、皺縮、缺損、雙頭等）、頸部畸形試驗(yàn)方法小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第11頁(yè)3.精子整體結(jié)構(gòu)觀察：（頸部膨大、纖細(xì)、屈折、不全、雙體等）、尾部中段畸形（膨大、纖細(xì)、彎曲、屈折、不全、雙體等）、尾部主段畸形，然后分類計(jì)數(shù)。有精子尾部發(fā)育未完成，為未成熟精子，可計(jì)為畸形精子。試驗(yàn)方法小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第12頁(yè)4.精子頂體結(jié)構(gòu)觀察：精液抹片自然干燥10～20min，以1～2ml福爾馬林磷酸緩沖液固定15min,水洗后自然干燥。用姬姆薩工作液染色90min，水洗，風(fēng)干。置于1000倍顯微鏡下用油鏡觀察，計(jì)數(shù)頂體異常精子。鏡下可觀察到大多數(shù)精子頂體結(jié)構(gòu)正常，部分精子頂體異常，精子頂體異常主要表現(xiàn)為腫脹、缺損、部分或完全脫落。試驗(yàn)方法小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第13頁(yè)

剖開小鼠腹腔時(shí)，剪刀頭要向上，以防止剪破腹腔血管和內(nèi)臟，影響試驗(yàn)結(jié)果觀察。試驗(yàn)注意事項(xiàng)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第14頁(yè)試驗(yàn)結(jié)果及分析

1.雄性小鼠生殖器官主要由哪幾個(gè)部分組成？

2.繪制小鼠精子結(jié)構(gòu)圖？

3.從外觀上看小鼠精子由哪幾部分組成？你都觀察到了哪幾個(gè)畸形結(jié)構(gòu)？將經(jīng)典畸形結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖示。小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第15頁(yè)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第16頁(yè)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第17頁(yè)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第18頁(yè)小鼠睪丸附睪和輸管子采集運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)和結(jié)構(gòu)觀察專家講座第19頁(yè)頂體缺損小鼠睪丸附睪和輸管子采集