PCR反應體系中各種成分的作用資料不同模板濃度的實驗結果用相同的引物、兩種不同的模板，對6種不同模板量進行ＰＣＲ擴增，發(fā)現(xiàn)在模板量<25ｎｇ的條件下，擴增產物強度相應減弱，大約到2ｎｇ左右時無擴增產物；當模板量在25ｎｇ～200ｎｇ之間時，擴增產物基本穩(wěn)定，條帶清晰、穩(wěn)定，分辨率高；當模板量>200ｎｇ時，會出現(xiàn)大片段擴增產物的缺失或無擴增產物，且點樣孔至泳道會出現(xiàn)相應增強的彌散背景。綜合考慮，在25μｌ的ＰＣＲ反應體系中，模板ＤＮＡ以25～100ｎｇ為最適用量。同時模板ＤＮＡ在200ｎｇ以下不影響擴增結果，但為降低ＴＥ緩沖液中ＥＤＴＡ對反應體系中Ｍｇ2+的不良影響程度，應該盡量降低ＤＮＡ模板用量。不同Ｍｇ2+濃度時實驗結果設置不同Ｍｇ2+濃度，當Ｍｇ2+濃度為10ｍＭ時，無ＰＣＲ擴增產物;Ｍｇ2+濃度為15～25ｍＭ時，隨著Ｍｇ2+濃度的增加,ＰＣＲ擴增產物帶型基本一致，但以20ｍＭ的擴增效果最好不同引物濃度對ＰＣＲ結果的影響設置5種不同濃度的引物進行ＰＣＲ擴增，當引物濃度在01～02μＭ時，擴增結果基本一致；但隨著引物濃度的逐漸增加，開始出現(xiàn)彌散背景增強的趨勢，并且有些擴增帶發(fā)生減弱或缺失。為了保證反應結果的穩(wěn)定性和特異性，引物濃度以0.2μＭ左右為宜。不同ｄＮＴＰ濃度對ＰＣＲ結果的影響采用2種引物(ＯＰＢ17、ＯＰＡ16)，分別以4種不同的ｄＮＴＰ濃度進行ＰＣＲ反應，發(fā)現(xiàn)ｄＮＴＰ濃度在100μＭ、150μＭ、200μＭ、300μＭ時，隨著濃度的減小，擴增帶明顯減少或擴增強度減弱，當ｄＮＴＰ濃度<200μＭ時，擴增產物豐富、清晰、帶濃，擴增片段產率與ｄＮＴＰ濃度呈正相關。綜合考慮，以100～200μＭ的ｄＮＴＰ濃度為佳。ＴａｑＤＮＡ聚合酶對擴增結果的影響設置5個梯度的ＴａｑＤＮＡ聚合酶濃度，結果表明隨著ＴａｑＤＮＡ聚合酶濃度的增高，擴增產物量呈增多趨勢。在05ｕ～25ｕ濃度間均有擴增產物，但隨著ＴａｑＤＮＡ聚合酶濃度增加的同時，彌散背景也相應增強。綜合考慮,ＴａｑＤＮＡ聚合酶濃度以10～15ｕ結果較好。不同退火溫度下的擴增效果引物用ＯＰＤ16和ＯＰＡ01，按照優(yōu)化的ＰＣＲ反應體系將退火溫度分別設置為33℃、36℃、39℃、42℃。結果表明隨著退火溫度降低，非特異性產物增加，有彌散背景；退火溫度升高，特異性相對增加。Ｍｇｃｌ2與ｄＮＴＰ互相作用及對ＰＣＲ反應的影響用同一引物ＯＰＤ07、相同模板ＤＮＡ比較3種ＭｇＣｌ2濃度與3種ｄＮＴＰ濃度完全隨機相結合的9個處理的ＰＣＲ結果，研究了Ｍｇｃｌ2與ｄＮＴＰ的相互作用。結果表明,Ｍｇｃｌ2在低濃度時,。過量的ｄＮＴＰ對Ｍｇ2+的螯合作用明顯，表現(xiàn)為降低Ｍｇ2+的酶催作用,ＰＣＲ擴增產物減少或無，而低量的ｄＮＴＰ對Ｍｇ2+酶催的抑制作用減少,ＰＣＲ擴增產物增多。在高濃度Ｍｇｃｌ2濃度下,ｄＮＴＰ無抑制作用。在相同Ｍｇ2+離子濃度和足量ｄＮＴＰ時，擴增產物相似。1-9泳道分別代表Ｍｇｃｌ2(ｍＭ)/ｄＮＴＰ(μＭ)的濃度(1/100、1/200、1/300、2/100、2/200、2/300、3/100、3/200、3/300)。標準的PCR反應體系：10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umo