微生物形態(tài)觀察

—霉菌的形態(tài)觀察在生活中，你有沒有見到過相似的情境？？食物表面長的是什么東東？？霉菌的簡介一、霉菌的概況二、霉菌的生長繁殖三、霉菌的形態(tài)觀察一、霉菌的概況常用與常見霉菌的代表屬（一）根霉（Rhizopus)分布形態(tài)特征繁殖方式應(yīng)用根霉的菌體形態(tài)（二）毛霉（Mucor)分類地位分布形態(tài)特征繁殖方式代表種—總狀毛霉、高大毛霉、魯氏毛霉、梨形毛霉應(yīng)用毛霉

(a)單軸式孢囊梗(b)假軸式孢囊梗

(c)孢子囊結(jié)構(gòu)（三）曲霉(Aspergillus)分類地位分布形態(tài)特征繁殖方式代表種應(yīng)用曲霉（四）青霉（Penicillum):分類地位分布形態(tài)特征繁殖方式代表種應(yīng)用二、霉菌的生長繁殖三、霉菌的形態(tài)觀察

原理：

霉菌為真核微生物，菌絲較粗大，有分枝或不分枝的。菌絲體為五色透明或暗褐色至黑色，或呈現(xiàn)鮮艷的顏色。在顯微鏡下觀察時，菌絲皆呈管狀。在固體培養(yǎng)基上生長，為絨毛狀或棉絮狀。一些較高等的霉菌絲狀管道中皆有橫隔，由橫格狀菌絲隔成許多細(xì)胞。細(xì)胞易收縮變形，而且孢子很容易分散，所以制標(biāo)本時常用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液。該染色液使細(xì)胞不變形，具有防腐殺菌作用，且不易干燥．，能保持較長時間，溶液本身呈藍(lán)色，有一定的染色效果。

此外，為了得到清晰、完整并保持自然狀態(tài)的霉菌形態(tài)，還可以利用載玻片培養(yǎng)法或玻璃紙透析培養(yǎng)法進(jìn)行觀察。載玻片培養(yǎng)法是在一定濕度的培養(yǎng)皿中，放人一霉菌載片培養(yǎng)物，并蓋上一塊蓋玻片，使霉菌在一狹窄的空隙中生長、繁殖便于在顯微鏡下觀察霉菌的特殊形態(tài)構(gòu)造，如曲霉的足細(xì)胞、分生孢子、頂囊等生長情況。并且還可在同一標(biāo)本上觀察到它們不同階段的生長、發(fā)育狀況。玻璃紙透析培養(yǎng)法，是利用玻璃紙的半透膜特性及透光性，將霉菌生長在覆蓋于瓊脂培養(yǎng)基表面的玻璃紙上，然后將長菌的玻璃之間取一小片，貼放在載玻片上，置于顯微鏡下觀察。本實(shí)驗(yàn)以制片觀察和載玻片培養(yǎng)觀察為主。

材料、用具1.菌種黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、腐乳毛霉、黑根霉。2.培養(yǎng)基察氏培養(yǎng)基3.其他顯微鏡、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、水浴鍋、乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液、載玻片、蓋玻片、無菌水、接種環(huán)、接種鉤、解剖針、酒精燈、火柴、濾紙、玻璃鉛筆等。

方法（一）操作方法(一)制片觀察法(1)于一潔凈載玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍(lán)溶液，用解剖針或接種鉤從菌落邊緣處取少量帶有孢子的菌絲于染色液中，再細(xì)心地把菌絲挑散開，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。(2)置于顯微鏡下，觀察霉菌的形態(tài)。

(二)載玻片培養(yǎng)觀察法1.無菌培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備在一潔凈干燥的培養(yǎng)皿內(nèi)，放一鋁絲制載玻片架，再放人分別用紙包好的潔凈載玻片1-2片及蓋玻片1-2片，然后蓋上皿蓋，包扎后滅菌備用。2.霉菌載玻片培養(yǎng)物的制備（1）取約3ml經(jīng)滅菌后的察氏培養(yǎng)基試管，標(biāo)上青(毛、根或曲)霉字樣。（2）以無菌操作方式取出無菌培養(yǎng)皿中的載玻片和蓋玻片，打開備用。（3）取一標(biāo)好字樣的試管培養(yǎng)基，于酒精燈上以微火融化。方法（二）(4)待融化后的培養(yǎng)基冷卻至45t左右時，接人標(biāo)明菌名的相應(yīng)霉菌孢子一環(huán)，攪拌均勻，立即取大約3-4環(huán)于載玻片中央，然后迅速蓋上無菌蓋玻片，并于載玻片右上角標(biāo)明菌名。(5)往培養(yǎng)皿中倒人約3ml的無菌水。(6)將上述制備好的載玻片置于培養(yǎng)皿中的玻片架上，蓋上皿蓋，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，取出，置于顯微鏡下觀察霉菌的形態(tài)。

3.黑曲霉平板培養(yǎng)物的制備(1)在水浴鍋中，融化大試管察氏培養(yǎng)基1管。(2)將上述以融化的培養(yǎng)基以無菌操作方式注入已滅過菌的空培養(yǎng)皿中，待凝。(3)于上述培養(yǎng)皿中央，點(diǎn)上黑曲霉孢子少許。(4)置于28t培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，取出，用低倍鏡觀察曲霉的足細(xì)胞和匍甸菌絲。

(三)玻璃紙透析培養(yǎng)觀察法(1)向霉菌斜面試管中加入5ml無菌水洗下孢子，制成孢子懸液；(2)用無菌鑷子將已滅菌的直徑與培養(yǎng)皿相同的圓形玻璃紙覆蓋在察氏培養(yǎng)基平板上；(3)用1ml的無菌移液管吸取0.2ml孢子懸液于上述玻璃紙平板上，并用無菌玻璃棒涂抹均勻；(4)置于28t培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)皿。打開皿蓋，用鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分開，再用剪刀取一小片，置于載玻片上，用顯微鏡觀察其特殊形態(tài)。

方法（三）作業(yè)1.你能否通過顯微鏡觀察，區(qū)分出上述四類霉菌。2.將顯微鏡下所觀察到的各種霉菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)描繪出來，并注明名稱。3.列表比較各種霉菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的異同。4.比較酵母菌、細(xì)菌、霉菌形態(tài)上的異同。

①糖化酶的應(yīng)用與生產(chǎn)糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（GlucoamylaseEC.3.2.1.3），又名淀粉葡萄糖苷（Amyloglucosidase）或γ-淀粉酶（γ-amylase），是一種含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60～1000kDa之間。因發(fā)酵工業(yè)中大量用作淀粉糖化劑，習(xí)慣上簡稱糖化酶。

糖化酶是淀粉糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精和葡萄糖漿的主要酶類。特別是釀酒酵母利用淀粉原料發(fā)酵時，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因?yàn)榇蠖鄶?shù)釀酒酵母只能利用可發(fā)酵的糖進(jìn)行酒精發(fā)酵。糖化酶不僅用于酒類、酒精生產(chǎn)和葡萄糖漿的制取，還廣泛地用于抗生素、氨基酸、有機(jī)酸的生產(chǎn)。糖化酶是我國產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的酶制劑之一。糖化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用目前，工業(yè)中廣泛使用黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、米根霉(Rhizopusoryzae)和臭曲霉(Aspergillusfoetidus)為生產(chǎn)菌株來發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶。今天的實(shí)驗(yàn)用酶就是利用黑曲霉變異菌株進(jìn)行液體深層通風(fēng)發(fā)酵后提取獲得。②糖化酶的作用機(jī)制糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端（整個碳鏈只有一個還原端，與之相對的都是非還原端）依次水解a-1,4糖苷鍵,切下一個個葡萄糖單元，并像β-淀粉酶一樣,使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成β-D-葡萄糖。對于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點(diǎn)時，它也可以水解a-1,6糖苷鍵，由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3連接的碳鏈，但水解a-1,4糖苷鍵的速度最快，它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。

③酶活測定方法測定糖化酶的方法有次碘酸鈉法、蘭–愛農(nóng)法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和對硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水楊酸(DNS)等方法。

本試驗(yàn)測定糖化酶活力采用次碘酸鈉法。糖化酶以可溶性淀粉為底物在一定條件下（pH范圍是4～6,溫度范圍是40～60℃）進(jìn)行反應(yīng)，生成的葡萄糖用次碘酸鈉法定量測定。以單位時間內(nèi)分解α–１，４糖苷鍵生成葡萄糖所需的酶量為酶的活力單位。次碘酸鈉法：

碘與NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性條件下，未與C6H12O6

作用的NaIO可轉(zhuǎn)變成I2

析出,因此只要用Na2S2O3

標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2

，便可計(jì)算出未參與反應(yīng)的NaIO，由此推導(dǎo)出糖化酶催化所產(chǎn)生的C6H12O6

的含量。

1.I2

與NaOH作用:I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2.C6H12O6

與NaIO定量作用:C6H12O6+NaIO=C6H12O7+NaI3.C6H12O6反應(yīng)完后,剩余的NaIO在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng):3NaIO=NaIO3+2NaI4.歧化產(chǎn)物在酸性條件下進(jìn)一步作用生成I2:NaIO3+5NaI+6H2SO4=3I2+6Na2SO4+3H2O5.析出的I2

可用標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3

溶液滴定之:I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI注釋

在這一系列的反應(yīng)中，1mol葡萄糖與1molNaIO作用，而1molI2產(chǎn)生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖與1molI2

相當(dāng)。只要得出對照組和實(shí)驗(yàn)組所消耗的硫代硫酸鈉體積，兩者相減就可以得出與葡萄糖反應(yīng)的那部分次碘酸鈉的量，從而可以確定酶解生成的葡萄糖的量，從而計(jì)算出酶活。I2NaIONaIO3I2完全歧化反應(yīng)，無葡萄糖I2NaIONaIO另一部分歧化反應(yīng)生成NaIO3NaIO一部分與葡萄糖反應(yīng)I2實(shí)驗(yàn)組對照組四、操作步驟1.取7個帶塞的試管（其中3個測今年批次的酶活、另外3個測去年批次的酶活、1個作空白對照），分別吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸緩沖液2.5ml，混勻后于40℃水浴中預(yù)熱10min。2.加入酶液0.5ml（空白對照組以煮沸失活的酶液代替）于40℃，反應(yīng)10min；反應(yīng)結(jié)束時，立即于沸水浴加熱5min使酶失活(此時應(yīng)將試管的塞子打開）。3.取上述反應(yīng)液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，緩慢加入0.1mol/LNaOH溶液5ml(注意:加堿速度不能過快,否則過量NaIO來不及氧化C6H12O6

而歧化為不與C6H12O6反應(yīng)的NaIO3

和NaI,使測定結(jié)果偏低)，搖勻后在暗處放置15min后加入2mol/L硫酸2ml；4.以0.5%可溶性淀粉為指示劑（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。記錄0.1N硫代硫酸鈉消耗的毫升數(shù)：酶液樣品（A）、空白對照（B）；5.計(jì)算：(1)在上述條件下，1ml酶液每小時催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位：酶活力單位（U/ml）=（B－A）×（N/2）×180.1×（8/5）×2×（60/10）式中:B——空白滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)；A——酶液滴定消耗的硫代硫酸鈉毫升（ml）數(shù)（取3次滴定的平均值）；

N——硫代硫酸鈉的當(dāng)量濃度。

180.1——葡萄糖的摩爾質(zhì)量。

8/5——表示從8ml酶反應(yīng)體系取出5ml反應(yīng)液。

2——所加酶液為0.5ml，按定義為1ml。

60/10——表示酶反應(yīng)時間為10min，按定義為1h。（2）在上述條件下，1ml酶液每分鐘催化2%淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）：酶活力單位（U/ml）=（B－A）×10-3×（N/2）×（8/5）×106×2

×（1/10）式中符號與前式相同，其中：

10-3——ml換算成L。

106——μmol換算成mol。方法二：DNS法測定糖化酶活力糖化酶有催化淀粉水解的作用，能從淀粉分子非還原性末端開始，分解α-1,4-葡萄糖苷鍵生成葡萄糖。在煮沸條件下，葡萄糖在堿性介質(zhì)中被3,5-二硝基水楊酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水楊酸被還原成紅褐色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出淀粉經(jīng)糖化酶水解后產(chǎn)生的葡萄糖總量。操作步驟1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取7支25mL具塞刻度比色管編號，按表1分別加入濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min，取出，冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色。調(diào)波長540nm，用0號管調(diào)零點(diǎn)，測出1~6號管的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。管號1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）吸光度（A540nm）0021.5010.21.81.50.2

20.41.61.50.4

30.61.41.50.6

40.81.21.50.851.01.01.51.0

61.20.81.51.22、糖化酶活力測定將糖化酶粉劑或濃縮液稀釋至20~40單位/毫升，制成酶制備；取甲、乙兩比色管（50毫升），分別加入2%可溶性淀粉溶液25ml和0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖溶液5ml，搖勻，放入40℃士0.2℃的恒溫水浴鍋中水浴5-10分鐘；在甲管中加酶制備液2ml,搖勻，并記錄時間，反應(yīng)10分鐘后,立即加入20%NaOH溶液0.2毫升,搖勻；將兩管取出冷卻,并于