jing_jiang1974@QQ:1336754154生物制藥教研室(A511)112021/5/912酶蛋白制備分離選育構(gòu)建表達(dá)發(fā)酵生產(chǎn)分離純化產(chǎn)酶菌株發(fā)酵液酶制品知識(shí)回顧2021/5/923

第四章酶的提取與分離純化預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細(xì)胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。純化工藝評(píng)價(jià)2021/5/93基因工程酶/蛋白分離純化的一般流程2021/5/942021/5/956

第一節(jié)酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理目的：提高固液分離效率使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移用于后處理相中去除部分雜質(zhì)(一)發(fā)酵液的相對(duì)純化1.無機(jī)離子的去除2.雜蛋白質(zhì)的去除3.色素及其他物質(zhì)的去除（降低離子強(qiáng)度、酶活性影響）（沉淀、變性、凝聚和絮凝、吸附）2021/5/967(二）發(fā)酵液的固液分離1.影響發(fā)酵液過濾的因素

1）菌種2）培養(yǎng)基組成2.提高過濾性能的方法1）絮凝和凝聚2）稀釋、加熱3）加助濾劑，常用硅藻土等。

主要方法是離心分離和過濾2021/5/978二、細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶）

（一）細(xì)胞壁組成

細(xì)胞壁的主要成分：細(xì)菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)真菌:多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖）

2021/5/989各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成

2021/5/9910

細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

2021/5/910酵母菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)

M—甘露聚糖；P—磷酸二酯鍵；G—葡聚糖

2021/5/91112（二）細(xì)胞破碎的方法

機(jī)械法機(jī)械搗碎法研磨破碎法勻漿破碎法高壓勻漿法超聲破碎法非機(jī)械法酶法化學(xué)法物理法干燥法2021/5/912131.機(jī)械法：

1）液體剪切：攪拌、勻漿。2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。3）超聲波破碎法。2.非機(jī)械法——物理法1）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。2）凍融法：反復(fù)低溫冰凍，室溫融化。2021/5/913143.酶解法（enzymaticlysis）：

外加酶法：根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿浮?/p>

自溶法（autolysis）:細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā)生溶解的現(xiàn)象。2021/5/914154.化學(xué)法

應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。

1）有機(jī)溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

2）表面活性劑處理：常用非離子型表面活性劑，如TritonX-100，Tween等。2021/5/91516破菌分離策略酶法+高壓勻漿/超聲鹽及表面活性劑低濃度的變性劑DetergentIntactmembraneDetergentDetergent-solubilizedproteinsa2021/5/91617（三）細(xì)胞破碎確認(rèn)

1.直接測(cè)定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：

破碎前，用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)；破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。

2.測(cè)定導(dǎo)電率：利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測(cè)定破碎程度。

3.測(cè)定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測(cè)定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。

2021/5/91718三、酶的提取(extraction)

把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。

2021/5/91819提取目標(biāo)：a.將目的酶最大限度地溶解出來。b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。2021/5/91920提取原則a.相似相溶。b.遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。2021/5/92021提取方法：（一）鹽溶液提取

常用稀鹽（常用NaCl）溶液（鹽溶），對(duì)酶穩(wěn)定性好、溶解度大，最常用。

（二）酸、堿溶液提取（三）有機(jī)溶劑提取2021/5/92122四、離心分離三種形式：1）離心沉降2）離心過濾3）離心分離和超離心

2021/5/92223（一）基本原理1.離心力

Fc=mac＝mr

ω2＝mr（2N/60）2

N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；Fc通常以相對(duì)離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替

r平均=1/2（r大+r?。ヽm2021/5/923242.沉降系數(shù):（sedimentationconstant）

指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentationvelocity）,用S表示。由于許多生物大分子的S值很小，所以定義1013s

為一個(gè)沉降單位，1S=11013s。

常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1~200之間。

2021/5/92425（二）離心機(jī)的種類按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同，分為：常速（低速）高速超速

2021/5/92526離心機(jī)的種類

2021/5/92627實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)溫度類型：常溫及冷凍超速離心機(jī)均為冷凍型。使用冷凍離心機(jī)時(shí)提前降溫，預(yù)冷離心頭。使用超速離心機(jī)時(shí)先抽真空。2021/5/92728離心的形式角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式由低速到超速均有。2021/5/92829角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。2021/5/92930離心機(jī)的大小：落地式及臺(tái)式2021/5/93031小臺(tái)式離心機(jī)2021/5/93132離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：和離心速度相配大小：和轉(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋2021/5/93233離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時(shí)。2021/5/93334（三）常用離心方法

差速離心法沉降速度法密度梯度離心沉降平衡法等密度梯度離心2021/5/934351．差速離心

（differentialcentrifugation）

采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。2）沉降的顆粒受到擠壓。2021/5/93536

差速離心分離示意圖

（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時(shí)間后顆粒的沉降情況

2021/5/936372021/5/937382．密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。

常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。2021/5/93839特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。2021/5/93940

密度梯度離心示意圖

（a）離心前（b）離心后

2021/5/94041Densitygradientultracentrifugation2021/5/94142密度梯度離心

步驟：A.形成密度梯度B.加樣C.離心D.收集樣品2021/5/942433.等密度梯度離心

又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根據(jù)顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。離心時(shí)，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時(shí)不再移動(dòng)，形成區(qū)帶。2021/5/94344常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點(diǎn)：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。2021/5/94445

等密度梯度離心示意圖

（a）離心前；（b）離心后

2021/5/94546沉降速度離心和沉降平衡離心的特點(diǎn)2021/5/946472021/5/94748（四）離心條件離心力:RCF=1.1210-5N2r

離心時(shí)間:t=K/S*(最高立離心速度/所需離心速度)2K=(lnr2-lnr1)/ω2==(lnr2-lnr1)×2.35×1011/n2溫度和pH:2021/5/94849五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龉爬?、?shí)用、簡(jiǎn)單的初步分離方法2021/5/94950在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：

⑴中性鹽沉淀（鹽析法）

⑵有機(jī)溶劑沉淀

⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）

⑷等電點(diǎn)沉淀

⑸有機(jī)聚合物沉淀2021/5/95051（一）鹽析沉淀法（改變離子強(qiáng)度）1.基本原理（鹽溶和鹽析）

向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。

2)鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。2021/5/95152蛋白質(zhì)的鹽析硫酸銨對(duì)馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強(qiáng)度鹽析鹽溶2021/5/95253

原因：高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。2021/5/95354蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域

2021/5/954552021/5/955562021/5/956571）中性鹽的選擇常用（NH4）2SO4，其突出優(yōu)點(diǎn)：a.溶解度大

b.分離效果好c.不易引起變性d.價(jià)格便宜2.鹽析用鹽2021/5/957582)鹽濃度的表示用飽和（溶解）度表示:溶液中飽和硫酸銨的體積飽和度＝溶液的總體積2021/5/958593)調(diào)整鹽濃度的方式

a.飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時(shí)。配制飽和硫酸銨溶液2021/5/95960所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計(jì)算：S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積S2,S1——分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度2021/5/96061b.添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時(shí)。按下式計(jì)算，得表中數(shù)據(jù)B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常數(shù)，與溫度有關(guān)。實(shí)際使用時(shí)，可直接查表（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。2021/5/96162調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表2021/5/96263鹽析操作低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40％。高飽和度：固體鹽添加法。不會(huì)大量增加溶液體積。1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。2）冰箱中（4℃）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。3）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration）、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。2021/5/963643.鹽析曲線的制作

如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力102030405060708090100硫銨飽和度％2021/5/96465

硫酸銨濃度（%）枯草桿菌-淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線

2021/5/965664.鹽析的影響因素1)離子強(qiáng)度和種類（介紹鹽析常數(shù)）蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：I：離子強(qiáng)度，I=∑MZ2；M：離子濃度（mol/L）；Z：離子價(jià)數(shù)S：離子強(qiáng)度為I時(shí)的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）S0：離子強(qiáng)度為0時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）Ks：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)和鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。Ks代表鹽析效率，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。

2021/5/96667當(dāng)溫度一定時(shí)，S0對(duì)于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用β表示，鹽析方程式可改寫為：

logS=β-KsI

兩種鹽析法：Ks分級(jí)鹽析法：在一定的pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強(qiáng)度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。β分級(jí)鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下，通過改變?nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法。2021/5/967682021/5/968692)蛋白質(zhì)濃度：過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等電點(diǎn)處最易沉淀。4)溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。一般可在室溫下進(jìn)行。某些對(duì)溫度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。2021/5/96970（二）有機(jī)溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）利用酶等蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。1.沉淀機(jī)理降低溶液的介電常數(shù)部分地引起蛋白質(zhì)脫水2.常用有機(jī)溶劑丙酮乙醇甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。

2021/5/970713.優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：1）分辨率比鹽析法高

2）沉淀不需脫鹽3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點(diǎn)：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活2)有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求較高。

2021/5/971724.影響有機(jī)溶劑沉淀的因素（1）溫度：低溫（0℃）操作。（2）pH值：盡可能靠近其等電點(diǎn)。（3）離子強(qiáng)度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度目的防止蛋白質(zhì)變性（4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml2021/5/97273（三）等電點(diǎn)沉淀(isoelectricprecipitation)

1.原理蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)

2.使用方法單獨(dú)使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機(jī)溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)仍有一定的溶解度。2021/5/973743.優(yōu)點(diǎn)：1）大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)2）無機(jī)酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價(jià)格較低3）無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化4.缺點(diǎn)：

酸化時(shí)，容易引起蛋白質(zhì)失活

2021/5/97475（四）有機(jī)聚合物沉淀法

1.作用機(jī)理：與有機(jī)溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。2.沉淀劑：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，簡(jiǎn)寫PEG）多用分子量為6000～20000的PEG。3.優(yōu)點(diǎn)：①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。2021/5/97576（五）選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。

⑴熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵pH變性等電點(diǎn)沉淀法是pH變性法中的一種變體。

⑶有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)有機(jī)溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。2021/5/97677六、萃取（extraction）分離

利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。特點(diǎn)：1）比化學(xué)沉淀法分離程度高2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快3）比蒸餾法能耗低

2021/5/97778（一）溶劑萃取法明確幾個(gè)概念：料液：供提取的溶液。

溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì)。萃取劑：用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機(jī)溶劑。萃取液：經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與萃取劑形成的溶液。萃余液：被萃取出溶質(zhì)后的料液。反萃?。╞ackextraction）：完成萃取操作后，將產(chǎn)物從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。

2021/5/97879溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律）為基礎(chǔ)。在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑里，達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。萃取相濃度C1分配系數(shù)K0=——————=——萃余相濃度C2K0值隨溶液pH的變化甚大，這是用萃取法實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。2021/5/97980

普通有機(jī)溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，

因?yàn)?1）蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機(jī)溶劑2）蛋白質(zhì)在有機(jī)相中易變性失活故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取。

2021/5/98081萃取操作的3個(gè)步驟：1）混合2）分離3）溶劑回收2021/5/98182（二）雙水相萃取技術(shù)

又稱水溶液兩相分配技術(shù)（partionoftwoaqueousphasesystem）

用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%?90%），故稱“雙水相”系統(tǒng)。

2021/5/98283優(yōu)點(diǎn)：1）每一水相中均有很高的含水量，為酶等生物物質(zhì)提供了一個(gè)良好的環(huán)境；2）PEG、Dextran和無機(jī)鹽對(duì)酶等無毒害作用，不會(huì)引起變性。

2021/5/98384雙水相的形成：

兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)到一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。

2021/5/984852021/5/98586

幾種典型的雙水相系統(tǒng)聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羥丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）葡聚糖（Dex）硫酸葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇羧基甲基葡聚糖鈉鹽甲基纖維素聚乙二醇（PEG）

磷酸鉀、硫酸銨硫酸鈉、硫酸鎂2021/5/986872.萃取原理：

利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。2021/5/987883.應(yīng)用

胞內(nèi)酶的提取和精制:除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。

2021/5/98889幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶Brevibacteriumsp.PEG/鹽天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽亮氨酸脫氫酶Bacillussp.PEG/Dex乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；窫.coliPEG/鹽2021/5/98990雙水相萃取法的重要研究方向——親和萃取（親和分配）

使用具有生物特異性的配基（ligand）來提高分離選擇性。

2021/5/99091親和萃取酶實(shí)例

蛋白質(zhì)配基胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶三嗪染料甲酸脫氫酶三嗪染料葡糖-6-磷酸脫氫酶三嗪染料2021/5/99192（三）超臨界流體萃取

兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。超臨界流體(supercriticalfluid，SCF）：超過氣液共存時(shí)的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點(diǎn)——臨界點(diǎn)后的流體。2021/5/99293（四）反膠團(tuán)萃取1.反膠團(tuán)：又稱反膠束（ReversedMicelles）指表面活性劑（由親水的極性基團(tuán)和疏水的非極性基團(tuán)兩部分組成）分散在連續(xù)有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級(jí)的聚集體。反膠團(tuán)模型親水基團(tuán)向內(nèi)聚集2021/5/993942021/5/994952.萃取過程第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相中，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的反萃取過程。2021/5/99596

反膠團(tuán)萃取原理

2021/5/996973.表面活性劑及有機(jī)溶劑

反膠團(tuán)萃取與溶劑萃取的不同，是在有機(jī)溶劑中加入了少量表面活性劑。2021/5/99798（1）表面活性劑

常用：AOT(AerosolOT)（陰離子表面活性劑，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸鈉）。特點(diǎn)：易獲得，強(qiáng)度好；極性基團(tuán)小，形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入。

（2）非極性有機(jī)溶劑環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。

2021/5/998994.優(yōu)點(diǎn)1）萃取率和反萃取率高。2）分離濃縮同時(shí)進(jìn)行，溶劑可反復(fù)利用。3）解決胞內(nèi)酶在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活問題。4）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。5）成本低。2021/5/999100酶的分離純化破菌上清或沉淀離心加緩沖液破碎離心發(fā)酵菌體發(fā)酵液粗包涵體包涵體溶解液洗脫收集液包涵體完全洗脫液超濾透析加緩沖液離心加緩沖液重復(fù)洗滌加緩沖液離心加緩沖液上柱純化沉淀粗純化精純化（制）鹽析、有機(jī)溶劑、PI沉淀粗體溶解液洗脫收集液溶解上清完全洗脫液超濾透析加緩沖液離心加緩沖液溶解透析置換緩沖液加緩沖液上柱純化上清分離2021/5/9100101第二節(jié)酶的精制（精純化）純化原理（掌握）基本原則（掌握）純化技術(shù)（掌握原理、選擇依據(jù)）2021/5/9101102純化方法依據(jù)原理：溶解度、特異性吸附、電荷、分子大小酶純化的基本原則：①建立一個(gè)方便靈敏的分析方法(純度、收率)；②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；③選擇適宜溫度，保持酶活性以避免酶的變性；④抗氧化失活（DTT,BME,EDTA,etc）；⑤其他添加劑，防止酶失活。第二節(jié)酶的精制（精純化）2021/5/9102103

酶精純化常用技術(shù)膜分離技術(shù)柱層析技術(shù)蛋白質(zhì)結(jié)晶透析超濾凝膠過濾（分子篩/排阻）層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析反相層析2021/5/9103104一、膜分離

借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)。2021/5/9104105膜分離技術(shù)的分類擴(kuò)散膜分離2021/5/9105106（一）擴(kuò)散膜分離——透析（dialysis）溶質(zhì)分子Y從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動(dòng)2021/5/9106107

1.透析膜1）特點(diǎn)：①多孔薄膜，允許小分子通過，阻止大分子通過；②化學(xué)惰性，多種溶液中不溶解；（材料：纖維素衍生物）③一定的機(jī)械強(qiáng)度；2）透析膜規(guī)格選擇（表4.11-4.12）2021/5/91071082）透析膜的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)。3）透析袋的保存：防腐劑＋冷藏。2021/5/9108109蛋白質(zhì)透析2021/5/91091102.透析方法及裝置

透析袋透析簡(jiǎn)單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖

2021/5/91101113.透析速度影響因素P164濃度梯度分子大小和形狀溫度膜表面積膜厚度2021/5/9111112（二）超濾

依據(jù)被分離物質(zhì)分子大小、形狀和性質(zhì)的不同，在外力作用下形成一定壓力差，使溶液中物質(zhì)在超濾膜表面發(fā)生分離，從而達(dá)到分離、提純和濃縮產(chǎn)品的目的。2021/5/91121131.超濾膜特點(diǎn)非對(duì)稱雙膜結(jié)構(gòu)，包括分離層和支撐層。超濾膜性能指標(biāo)包括滲透通量和截留率。2021/5/91131142.超濾裝置——實(shí)驗(yàn)室裝置2021/5/9114115根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：2021/5/9115116微濾(Microfiltration，MF)一種靜態(tài)過濾，隨過濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；2021/5/9116117常規(guī)過濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB2021/5/91171182021/5/91181192.超濾裝置——工業(yè)裝置中空纖維系統(tǒng)2021/5/9119120超濾膜包裝置2.超濾裝置——工業(yè)裝置2021/5/91201213.超濾膜的選擇及使用截留分子量流速材質(zhì)膜完整性清洗與保存4.影響流速的因素溶質(zhì)分子性質(zhì)溶質(zhì)濃度壓力攪拌溫度其他2021/5/9121122色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。（二）柱層析技術(shù)2021/5/9122123ColumnChromatography2021/5/9123124層析柱的制備與層析操作

柱層析的設(shè)備:層析柱、蠕動(dòng)泵（恒流泵）、檢測(cè)儀、部分收集器、梯度洗脫器。2021/5/9124125層析設(shè)備層析裝置：梯度混和器蠕動(dòng)泵層析柱監(jiān)測(cè)儀記錄儀收集器

2021/5/9125126記錄儀2021/5/9126127低溫層析柜2021/5/91271282021/5/9128129現(xiàn)代化層析設(shè)備

——AKTA層析柱XKBPG2021/5/9129130現(xiàn)代化層析設(shè)備——AKTA2021/5/9130131記錄系統(tǒng)2021/5/9131132良好的線性放大2021/5/9132133(一)凝膠過濾層析

凝膠過濾（gelfiltration）又稱分子篩層析（molecularsievechromatography）、排阻層析（exclusionchromatography）,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。2021/5/9133134（1）.基本原理

大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長(zhǎng)而后流出層析柱。2021/5/91341352021/5/91351362021/5/9136137Size-exclusionchromatography2021/5/9137138凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時(shí)的洗脫液體積（ml）2021/5/9138139凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時(shí),即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時(shí),即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。2021/5/9139140分配系數(shù)Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，Kd差異小，分離效果差。2021/5/9140141（2）.凝膠的種類和性質(zhì)

1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextrangel)商品名:Sephadex型號(hào)

SephadexG－10至G-200G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。2021/5/9141142葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)

2021/5/91421432）瓊脂糖凝膠（agarosegel)

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美國(guó)）依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。2021/5/91431443）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）

商品名為Bio-Gel,型號(hào)從Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。2021/5/91441452021/5/9145146（3）操作：1）凝膠的選擇和處理根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。2021/5/91461473）加樣體積不能過多，不超過床體積的5％，脫鹽時(shí)可在10％左右。4）洗脫洗脫液與平衡時(shí)用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。用0.02%NaN3防腐。2021/5/91471482021/5/91481494.應(yīng)用1）脫鹽２)生物大分子物質(zhì)的分離純化3）分子量的測(cè)定4）溶液濃縮2021/5/9149150（二）離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）2021/5/91501512.離子交換劑：離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。

纖維素瓊脂糖葡聚糖

載體電荷基團(tuán)—O—CH2—COO-—Na+反離子1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。2021/5/9151152離子交換劑--帶有電荷基團(tuán)的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))陽(yáng)離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))2021/5/9152153兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽(yáng)離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH32021/5/9153154

化學(xué)原料合成：樹脂類物質(zhì)載體

天然材料制成：cellulosesephadexsepharose

陽(yáng)離子交換劑:電荷基團(tuán)（－）,反離子（＋）電荷基團(tuán)陰離子交換劑:電荷基團(tuán)（＋）,反離子（－）

如：DEAE-Sepharose，CM-Sepharose2021/5/9154155

離子交換葡聚糖

以SephadexG-25,G-50為骨架，接入離子交換基團(tuán)。DEAE（QAE）SephadexA-25，A-50CM（SP）SephadexC-25，C-50

A：anion陰離子C:cation陽(yáng)離子2021/5/9155156

離子交換劑的選擇a.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：強(qiáng)型：適用的pH范圍廣弱型：適用的pH范圍窄b.陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性若<pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶正電荷，用陽(yáng)離子交換劑若>pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑2021/5/91561572）蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)41214268100系統(tǒng)pH+

蛋白質(zhì)帶正電荷

蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷等電點(diǎn)-pH值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù)2021/5/9157158實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷不同，因而與離子交換劑有不同吸附力而分離。pH6.0pI>6.0蛋白質(zhì)帶正電pI<6.0蛋白質(zhì)帶負(fù)電2021/5/91581592.陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程平衡吸附去吸附分離結(jié)束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-2021/5/9159160Ion-exchangechromatography2021/5/91601613.操作平衡上樣平衡洗脫再生1）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。2）洗脫:增加溶液的離子強(qiáng)度

梯度洗脫法

改變?nèi)芤旱膒H值

3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理。4.應(yīng)用制備純化生物大分子2021/5/9161162圖4-39梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度2021/5/9162163影響離子交換層析的主要因素PH離子強(qiáng)度層析介質(zhì)（流速、分辨率）2021/5/9163164（三）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）從分離純化的機(jī)制看，屬吸附層析類。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì)，根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。2021/5/9164165大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性，但分子內(nèi)部存在一個(gè)疏水核心，欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起，可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁（hydrophobicpatch），或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。原理:2021/5/9165166在高鹽濃度下，蛋白質(zhì)發(fā)生局部結(jié)構(gòu)可逆改變，被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起，然后通過降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì)，按其結(jié)合力大小，依次進(jìn)行解吸附。2021/5/91661672021/5/91671682.吸附劑

親水性（如Sepharose）基質(zhì)固定相疏水性（如硅膠、樹脂）配體（疏水性基團(tuán)）（苯基、辛基、烷基）2021/5/9168169一些商品疏水層析介質(zhì)

2021/5/91691703.操作1）加樣：樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。2）洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3）再生：除去固定相吸附的雜質(zhì)，用水或

8mol/L脲素溶液。4.應(yīng)用主要用于分離純化大分子物質(zhì)。2021/5/9170171（四）吸附層析（adsorptionchromatography）

1.原理利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。2021/5/91711722021/5/9172173吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。2021/5/91731742.吸附劑

吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。1）吸附劑的選擇：根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強(qiáng)吸附劑：氧化鋁、活性炭2021/5/91741752）吸附劑的性質(zhì)：活性炭：強(qiáng)吸附介質(zhì)，選擇性差，除色素。硅膠：常用的極性吸附介質(zhì)，有機(jī)小分子吸附。羥基磷灰石（HA）

[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)；酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。吸附原理是HA的Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。

分離純化生物大分子：DNA（不高于10ng/人劑量），Protein2021/5/9175176

（五）親和層析(AffinityChromatography)

由吸附層析發(fā)展起來的，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。又稱：功能層析（functionchromatography）生物專一吸附（biospecificadsorption）選擇層析（selectivechromatography）2021/5/91761771.原理及特點(diǎn)

（1）原理：將具有親和力的兩個(gè)分子中的一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一分子進(jìn)行純化。

（2）親和層析特點(diǎn)分辨率高分離速度快操作簡(jiǎn)單對(duì)設(shè)備要求不高親和吸附劑通用性差洗脫條件苛刻2021/5/9177178+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附2021/5/9178179Affinitychromatography2021/5/91791802.基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：①高度的親水性。②極低的非特異性吸附性（惰性）。③具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。④適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。⑤較好的理化穩(wěn)定性。2021/5/9180181可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體）：（按性能優(yōu)劣排序）瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。最常用的是瓊脂糖，Sepharose1B到10B2021/5/91811823.配體的選擇一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。

優(yōu)良配體須具備的條件：1）與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。2）具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。2021/5/9182183

目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基

2021/5/9183184當(dāng)前常用親和吸附介質(zhì)的配基酶底物（GST-GS）抗體（針對(duì)特定抗原）金屬離子（Ni-NTA）ProteinA（吸附Ig的Fc部位）2021/5/91841854.偶聯(lián)（親和吸附劑的制備）配體一定，改造載體（基質(zhì)）1）基質(zhì)活化：不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。2021/5/9185186溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2021/5/91861872）引入連接臂（spacearm）

又稱手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影響配基與生物大分子的結(jié)合的空間障礙?！敖颖邸钡耐緩剑撼Ｓ枚坊衔铮ǘ《?、乙二胺、己二胺）。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。如：AH-Sepharose4B2021/5/91871882021/5/9188189常用手臂2021/5/91891905.操作：1）層析前：選擇親和層析劑

選擇根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配基選擇根據(jù)配基分子大小及基團(tuán)特性載體2）洗脫：能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑2021/5/9190191非專一性洗脫：改變溫度改變pH值改變離子強(qiáng)度專一性洗脫：競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑（半抗原、抑制劑、底物類似物）被吸附物質(zhì)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性地與配體結(jié)合2021/5/91911926.應(yīng)用1）純化帶“標(biāo)簽（tag）”蛋白如：帶有His-tag，GST-tag蛋白純化2)抗體及Fc融合蛋白純化ProteinA2021/5/9192193(六)反相層析——高效（壓）液相層析（HPLC常用于分析）反相層析原理：同疏水層析，常用于高效液相層析特點(diǎn)：①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)（<5um），表面積很大,因而分辨率很高。②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。固定相（柱填料）：常用堅(jiān)硬、耐高壓，粒度小的硅膠。2021/5/9193194反相色譜中，蛋白質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，先被洗脫下來。即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強(qiáng)的蛋白質(zhì)。2021/5/91941951.HPLC原理

HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。許多類型的柱層析都可用HPLC來代替，如離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。2021/5/91951962.分類

按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類：離子交換色譜（IEX-HPLC）：——離子交換能力凝膠色譜（SEC-HPLC）：——分子大小而引起的體積排阻分配色譜：——分配系數(shù)2021/5/9196197分配色譜又可分為：

正相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。

反相色譜：固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。用的最多，約占60～70％。

固定相：硅膠填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴。

流動(dòng)相組成：常用“甲醇—H2O”。

2021/5/91971983.色譜儀組成1）進(jìn)樣系統(tǒng)2）輸液系統(tǒng)3）分離系統(tǒng)4）檢測(cè)系統(tǒng)5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2021/5/9198199PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity

ReversedPhase2021/5/9199200第三節(jié)酶蛋白常用的純度分析技術(shù)——電泳電泳（electrophoresis,EP）：

指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程。電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2021/5/9200201一、電泳的基本理論

1.原理:在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。+-2021/5/92012022.關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)：遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)內(nèi)在特性：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀）外界條件：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性2021/5/9202203

影響遷移率的因素：1）顆粒性質(zhì)：Q越大、r越小、形狀越接近球形，v越快。2）電場(chǎng)強(qiáng)度：E越高，v越快。3）溶液性質(zhì)：pH值：離pI越遠(yuǎn)，v越快。（用buffer保持恒定）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，v越低。原因：離子氛（ionicatmosphere）。通常，緩沖液離子強(qiáng)度在0.02-0.2之間。4）電滲：在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。2021/5/9203204區(qū)帶電泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。支持介質(zhì)的作用:防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散。2.電泳的分類2021/5/9204205按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。

2021/5/9205206③瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。④聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。2021/5/9206207

3.電泳常用設(shè)備

（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀（600V）

高壓電泳儀（3000V）

超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽：

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設(shè)備：

2021/5/9207208水平板式電泳槽垂直板式電泳槽2021/5/9208209二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。

2021/5/92092101.原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。2021/5/9210CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺2021/5/9211212

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1）化學(xué)催化系統(tǒng)：AP-TEMED催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（TEMED）催化劑:核黃素（維生素B2）

引發(fā)劑:光TEMED的存在，可加速聚合。.2021/5/9212213聚丙烯酰胺凝膠：丙烯酰胺＋N,N’－甲叉雙丙烯酰胺聚合而成2021/5/9213214凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）。

T=

C=凝膠濃度越大（?。讖皆叫。ù螅煞蛛x分子量較?。ù螅┑念w粒。Acr與Bis的重量比應(yīng)在30左右。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%2021/5/9214215聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表2021/5/92152162.分離效應(yīng)

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)

連續(xù)PAGE2021/5/9216不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。電荷效應(yīng):分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。

2021/5/9217218三、SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡(jiǎn)稱SDS－PAGE。是目前測(cè)定蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量（relativemolecularmass,Mr）的一種最好的辦法。2021/5/9218219

SDSseparatesproteinsbyMW2021/5/92192201.原理?

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長(zhǎng)度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。2021/5/9220221

蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對(duì)遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。2021/5/92212222021/5/92222232021/5/92232242.操作：（SDS及PAGE，即變性及非變性）1）制膠:（變性：buffer中加0.4%SDS）a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠（查表），配制分離膠溶液：Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。2021/5/92242252）樣品制備：a.PAGE:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖或甘油＋指示劑溴酚藍(lán)）b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍(lán)），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3）加樣及電泳：SDS:電極buffer中加0.1%SDS，溴酚藍(lán)距下端1cm時(shí)停止電泳。2021/5/92252264）固定及染色a.固定：將凝膠浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分。b.染色：

考馬斯亮藍(lán)染色法

銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍(lán)，過碘酸－Schiff試劑（糖蛋白）。2021/5/9226227電泳膠實(shí)例2021/5/9227228四、等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。2021/5/92282291.原理

兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自pI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)不再泳動(dòng)，被濃縮成狹窄的區(qū)帶。2021/5/9229230兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。(2)導(dǎo)電性能好——以保持電場(chǎng)強(qiáng)度的均勻性。(3)分子量小——電泳后易分離除去。(4)化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測(cè)定。2021/5/9230231等電聚焦電泳2021/5/92312322.操作：

1）凝膠配制：凝膠濃度T為5％~7.5％（C=3%左右）2）加樣：任意位置

2021/5/92322333）電泳：陽(yáng)極：磷酸溶液電極溶液陰極：NaOH溶液只有在凝膠兩端給予高電壓（600V）時(shí)，才能獲得較好的分辨率。而高電壓的維持需要有效的凝膠冷卻系統(tǒng)。4）固定及染色：TCA固定，考馬斯亮藍(lán)染色。2021/5/92332345）等電點(diǎn)測(cè)定：Marker與未知樣品同時(shí)電泳染色后，以pH值為縱軸，距陰極距離為橫軸，做pH梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)未知蛋白遷移距離可推知pI。IEF測(cè)定蛋白質(zhì)pI2021/5/9234235第四節(jié)

酶的濃縮、干燥與結(jié)晶一、酶的濃縮

(一)蒸發(fā)濃縮

圖4-60減壓蒸發(fā)濃縮的簡(jiǎn)易裝置1蒸餾瓶2毛細(xì)管3螺旋夾4橡皮管5溫度計(jì)6出水口7冷凝器8進(jìn)水口9連接管10抽氣口11接收瓶2021/5/9235236（二）

超濾濃縮