臨床常見病原體檢測Case1Onedayinsummer,ayoungmanwasadmittedtohospitalafterthreedaysofchills,jointpain,headache,cough,vomit,hepatosplenomegalyandahighfever.Totalleukocytecountwas25,900/mm3,ChestX-rayandurineroutinewerenormal.Aftertheinitialdiagnosiswithsuspectedsepticemia,hewastreatedbyTienam.Onthenext3days,hewasstillinabadwayandconsultedadermatologistduetoarash.Bloodculturewassterile.（4～10）×109/L1L=106mm3Tetracyclineforthetreatmentofscrubtyphus(rickettsiosis).Thenheallayedafever.Afteraweek,thepatientwasdischargedfromhospital.AlaboratorytestsuchasWeil-Felixtestwaspositive.臨床病原體檢查目的

明確感染是否發(fā)生以及病原體的類型。提供體外微生物藥物敏感實驗的結(jié)果。密切監(jiān)視烈性傳染病與新的傳染病的發(fā)生，及時向行政主管部門報告。配合相關(guān)機構(gòu)進行流行病學調(diào)查。臨床常見病原體檢測

5（一）教材資料

萬學紅盧雪峰主編，《診斷學》第九版，人民衛(wèi)生出版社，2018，第四篇第九章P443（二）拓展資源

參考教材：《實驗診斷學》（第四版），王建中，張曼主編，北京大學醫(yī)學出版社

《實驗診斷學》（第三版），尚紅、王蘭蘭主編，人民衛(wèi)生出版社

《檢驗醫(yī)學》（第二版），叢玉隆、尹一兵、陳瑜主編，科學出版社線上資源：/（三）教學內(nèi)容1.重點講練：臨床常見病原體檢測標本的采集運送原則、要求及方法；病毒性肝炎標志物檢測、性傳播疾病病原體檢測。2.難點分析：病原體耐藥性發(fā)生機制、藥敏試驗及耐藥菌監(jiān)測試驗。3.自學內(nèi)容：醫(yī)院感染常見病原體檢查。01020304概述病原體耐藥性檢測標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法臨床感染常見病原體檢測05病原性肝炎檢測+性傳播疾病病原體檢測（已學）06醫(yī)院感染常見病原體檢查（自學）1234601概述IntroductionPARTONE7項目建設時間進程天花印第安人幾乎滅絕1979消滅天花疫苗研發(fā)抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)14世紀15世紀末西班牙大流感死亡5千萬-1個億1918年2003年SARS>10%的死亡率尚無特效治療藥物鼠疫（黑死?。W洲總?cè)丝诘?/3死去2019年SARS-CoV-21260萬余人感染120萬余人死亡仍在全球流行尚無特效治療藥物人類歷史上的大規(guī)模疫情爆發(fā)感染性疾病的現(xiàn)狀感染性疾病的病原體：微生物（細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體等）和寄生蟲等?！褡詮目股氐陌l(fā)現(xiàn)和預防接種的實施，許多曾嚴重危害人體健康的病原體已消滅或基本消滅?！?/p>

InfectiousdiseasesareimportantworldwidecausesofmorbidityandmortalityAyoungBangladeshigirlinfectedwithsmallpox(1973)感染性疾病的現(xiàn)狀感染性疾病的病原體：微生物（細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體等）和寄生蟲等?！褡詮目股氐陌l(fā)現(xiàn)和預防接種的實施，許多曾嚴重危害人體健康的病原體已消滅或基本消滅。●

新的傳染病陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。Climatechangescenariosincludeachangeindistributionof

infectious

diseases

withwarmingandchangesinoutbreaksassociatedwithweatherextremeevents.

12Globally,asof

4:25pmCET,2December2020,therehavebeen

63,360,234

confirmedcases

ofCOVID-19,including

1,475,825

deaths,reportedtoWHO./13Globally,asof

5:42pmCET,17November2022,therehavebeen

633,263,617

confirmedcases

ofCOVID-19,including

6,594,491

deaths,reportedtoWHO.Asof

8November2022,atotalof

12,885,748,541

vaccinedoses

havebeenadministered./Coronavirusdisease2019(COVID-19)hasresultedinconsiderablemorbidityand

mortality

worldwide

sinceDecember2019.

感染性疾病的現(xiàn)狀感染性疾病的病原體：微生物（細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體等）和寄生蟲等?！褡詮目股氐陌l(fā)現(xiàn)和預防接種的實施，許多曾嚴重危害人體健康的病原體已消滅或基本消滅。●

新的傳染病陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)?！?/p>

曾絕跡的老傳染病部分死灰復燃。16TuberculardecayhasbeenfoundinthespinesofEgyptianmummiesintheBritishMuseum.MacNeilA,GlaziouP,SismanidisC,etal.Globalepidemiologyoftuberculosisandprogresstowardsachievingglobaltargets—2017.MMWRMorbMortalWklyRep2019;68:263–6.感染性疾病的現(xiàn)狀感染性疾病的病原體：微生物（細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體等）和寄生蟲等?！褡詮目股氐陌l(fā)現(xiàn)和預防接種的實施，許多曾嚴重危害人體健康的病原體已消滅或基本消滅●

新的傳染病陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，曾絕跡的老傳染病部分死灰復燃。●條件致病菌感染比例增加。多重耐藥菌株不斷出現(xiàn)，真菌感染的幾率逐年增高。02標本的采集運送、實驗室評價和檢查方法Transportationandcollectionofspecimen,laboratoryevaluationandexaminationmethodsPARTTWO18正確收集標本應遵循的原則

—SPECIMENCOLLECTIONISTHEMOSTIMPORTANTSTEP!

（1）Where無菌

versus

有菌

（2）When

（3）HowUrineSpecimenStoolSpecimen

無菌技術(shù)（容器/手法）足夠的量適當?shù)慕ㄗh完整的申請單CulturetteCary-Blair(4)StandardPrecautions一、常見標本的采集（血液）

1.適應癥：疑似菌血癥、敗血癥或膿毒血癥的病人。2.采血部位多為肘靜脈，切忌在靜滴抗菌藥物的靜脈處采集血標本，無菌操作。3.每次采血量為5ml左右，培養(yǎng)基與血液之比以10:1為宜。4.選擇體溫上升或高溫時采血。5.每例至少采血兩次，注意區(qū)別感染菌和皮膚污染菌。一、常見標本的采集(尿液

)

1.中段尿采集：最常用的方法。采樣前須消毒尿道口將中段或近后段的尿液留于無菌容器中。2.導尿管采集尿液：可減少污染，但易引起逆行感染，除非必要，須避免用此方法。3.膀胱穿刺采集尿液：病人恥骨上皮膚消毒后，以無菌針筒作膀胱穿刺。

此法主要用于尿液厭氧菌培養(yǎng)或嬰幼兒。AMAS408-AMSure?InfantUrineCollectionBag一、常見標本的采集(糞便

)有膿血粘液部分的新鮮糞便約2-3克送檢，也可用拭子挑取糞便插入Cary-Blair運送培養(yǎng)基中送檢對不易獲取糞便者，如嬰幼兒可用直腸拭子采集送檢。-Donotcollectthesamplefromthetoiletbowl-Donotmixtoiletpaper,water,orsoapwiththesample一、常見標本的采集(呼吸道標本）1.自然咳痰：清水反復漱口后用力咳嗽，從呼吸道深部咳出新鮮痰液于無菌容器內(nèi)送檢。以清晨第一口痰為好。2.氣管鏡下采集法、氣管穿刺法:理想標本，但不易接受和推廣。3.及時送檢和處理，最好不超過1小時。

(肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌)

4.

上呼吸道存在正常菌群，在采集標本與結(jié)果分析時應予考慮。

一、常見標本的采集(腦脊液等無菌體液）1.嚴格無菌條件下采集標本。2.盡量采集多的標本送檢。3.盡快送檢或床旁接種可提高陽性率，特殊標本需保溫送檢。如腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等。一、常見標本的采集

（傷口、燒傷創(chuàng)面、膿腫及其他）1.無菌清洗病灶表面后，用無菌拭子取病灶深部的膿液和分泌物，立即送檢。2.對未潰破的膿腫直接抽取膿液送檢，也可以切開排膿時用無菌拭子采樣。3.生殖道標本包括尿道口分泌物、外陰糜爛物、宮頸口分泌物、前列腺液等，應注意保溫。二、檢查方法1.直接涂片、鏡檢

初步診斷但陽性率低。2.病原體特異性抗原檢測免疫熒光技術(shù)、酶免疫技術(shù)、化學發(fā)光技術(shù)、膠乳凝集技術(shù)等。3.病原體核酸檢測

PCR、分子雜交、DNA測序等。

4.分離、培養(yǎng)、鑒定金標準較費時,同時可進行藥物敏感試驗。5.血清學檢查如肥達氏試驗、軍團菌抗體檢查等。應進行雙份血清檢測，兩次抗體效價相差4倍以上有意義。但不能進行早期檢測。6.細菌毒素7.質(zhì)譜MALDI-TOFMS，目前主要對分離出來的純菌落進行鑒定，一般不能對樣本直接進行檢測。03病原體耐藥性檢測DrugresistancetestPARTTHREE35The“RedQueenHypothesis”LewisCarroll’s《ThroughtheLookingGlass》RedQueen"Ittakesalltherunningyoucando,tokeepinthesameplace."

Thisisanappropriateanalogy:theenvironmentconstantlychangesandpopulationsmustcontinuetoevolvetosurvive.

耐藥機制

(1)產(chǎn)生滅活酶或純化酶

(2)改變抗生素作用部位的結(jié)構(gòu)

(3)改變外膜蛋白的通透性,藥物滲入細菌減少

(4)代謝拮抗物的產(chǎn)生或代謝旁路的產(chǎn)生

(5)細菌抗生素結(jié)合蛋白的改變

(6)細菌的外排系統(tǒng)

(7)生物膜的形成

（1）手工試驗

1.紙片擴散法（S，I，R）

2.稀釋法（MIC）

3.Etest（MIC）（2）自動儀器Vitek，Microscan，Phoenix（3）分子試驗PCR直接檢測mecA基因（4）酶試驗Nitrocefin、ESBL檢測檢查項目、結(jié)果和臨床應用藥物敏感試驗(antimicrobialsusceptibilitytestAST)K-B法E-試驗

對所有?內(nèi)酰胺類及與酶抑制劑的復合劑耐藥并對氨基糖甙類、大環(huán)內(nèi)脂類、克林霉素和四環(huán)素等抗生素多重耐藥。治療首選藥物為萬古霉素。FOX耐甲氧西林的葡萄球菌（methecillinresistancestaphylococcus，MRS）篩選試驗OXOXFOXOXFOX2.重點耐藥菌株監(jiān)測試驗注:OX為苯唑西林;FOX為頭孢西丁1.CTX/CA比CTX抑菌圈或CAZ/CA比CAX>5mm即為陽性2.若ESBLs陽性,對青霉素類、所有頭孢菌素類及單環(huán)類抗菌素耐藥3.主要在大腸埃希菌和克雷伯菌屬等腸桿菌科細菌中產(chǎn)生

CTXCTX/CACAZCAZ/CA注:CTX為頭孢噻肟;CTX/CA為頭孢噻肟/棒酸

CAZ為頭孢他啶;CAZ/CA為頭孢他啶/棒酸產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extendspectumβ-lactamase,ESBL)雙紙片確證試驗04臨床感染常見病原體檢測（自學）DetectionofcommonpathogensinclinicalinfectionPARTFOUR44傳統(tǒng)的診斷方法傳統(tǒng)的疾病診斷方法大多為表型診斷，以患者的臨床表現(xiàn)和病原體的表型檢測為依據(jù)。細菌感染檢查項目的選擇普通細菌：常采用直接鏡檢、分離培養(yǎng)與鑒定明確病原體。難培養(yǎng)或培養(yǎng)要求高的細菌：綜合運用免疫學或分子生物學檢測，如結(jié)核分枝桿菌感染以及幽門螺桿菌感染等。流行病學調(diào)查：病原體抗體檢測，如ASO試驗與Widal反應等。細菌培養(yǎng)是最重要的確診方法病毒可以用電子顯微鏡快速診斷，但是必須要有高量的病毒顆粒存在，而且方法也不方便病毒培養(yǎng)，但很慢而且常培養(yǎng)不出來（需試出適合病毒生長的細胞株）免疫學分子生物學病實毒驗感室染診性斷疾病的

其他新技術(shù)

病毒感染的潛伏期(窗口期)血清中并無抗體的存在，無法以免疫學的方法來檢測

PCR檢測病毒量的變化上，比傳統(tǒng)的方法更快速，有更高的特異性及靈敏度培養(yǎng)免疫熒光ELISAPCR檢測速度+++++++++/+++靈敏度+++++++++++特異性+++++++++++定量分析+++++++++方便性+++++++/+++HBV基因分型根據(jù)HBV基因序列差異，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型HBV分子檢驗診斷方法擴增位置引物序列擴增片段大小(bp)P、X基因特異片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’S基因特異片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特異片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’HBVDNA檢測（PCR）PCR引物是PCR擴增的關(guān)鍵，決定擴增的特異性和敏感度。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設計。部分常用的引物序列HBVDNAFQ-PCR（real-timePCR）結(jié)果判斷：FQ-PCR進行HBVDNA的定量檢測，檢測范圍為2.5×102~2.5×109

copies/ml檢測樣本中5×102

copies/ml≤HBVDNA≤5×107

copies/ml，測定結(jié)果有效，可直接報告相應的拷貝數(shù)檢測樣本中HBVDNA>5×107copies/ml，既可直接報告為>5×107copies/ml，也可用正常人血清按10倍梯度做相應稀釋，使其拷貝數(shù)落在1×105-5×107copies/ml范圍內(nèi)，再重新測定，測定結(jié)果應以稀釋倍數(shù)進行校正檢測樣本HBVDNA<5×102copies/ml時，拷貝數(shù)僅供參考，報告為小于最低檢出限Ct值無數(shù)值時,報告為0.0copies/mlHBV耐藥檢測（YMDD突變檢測方法）YMDD突變檢測方法1.基因測序法2.熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交

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