對真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實驗。很早就已知道，轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄活化蛋白上兩個相互獨立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding ,BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(Activation,AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的。目前酵母雙雜交實驗采用的系統(tǒng)有LexA系統(tǒng)和Gal4系統(tǒng)兩種。在LexA系統(tǒng)中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一個完整的原白LexA構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域則由一個88個氨基酸的酸性的大腸桿研究蛋白間的相互作用時，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即“誘餌”相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GALUAS）ADGALUASBD與AD分別表達的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BDAD才能與或存在相互作用。GAL4系統(tǒng)的原理如圖所示：

GAL4

BaitMel/Ade/His/LacZreporter陽性克隆在X-陽性克隆在X-α-Gal平板上的純化、。DNA-BD載體的目的DNA同以往研究蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗相比，雙雜交系統(tǒng)具有其獨特優(yōu)1ol/L間的相互作用可以借助表達過程中的多級放大效應(yīng)反映出來；融合蛋白強啟A得到編碼相互作用蛋白的序列，它只需構(gòu)建質(zhì)粒而不必準備抗體或純化蛋，省了其文庫DNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母菌文庫DNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母菌DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母菌DNA-BDDNA-BD與釣DNA融合的重組酵母中質(zhì)粒的提取及PCR酵母中質(zhì)粒的提取及PCR酶切分陽性克隆在X-α-Gal平板上的酵母質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化菌株Y187可利用所帶的IacZ來驗證兩個已知蛋白間的相互作用。菌株CG-1945可被用于用環(huán)己酰亞胺來分離BD-bait和AD-library質(zhì)粒。第二部分

LB液體培養(yǎng)基，121℃，15lbf/in2 5N 調(diào)pH 1000.0);（cfu/ml=按照>2-4104cfu/LB/Amp平板(φ150mm)100塊；37℃倒LB/Amp培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)2-4hr;質(zhì)粒DNA。一.

配方200mMNaOH;3.0M750mMNaCl;50mMMOPS,pH7.015%異丙醇0.15％TritonX-1.0MNaCl;50mMMOPS,pH7.015%二.勻4-6次);一.YPD(Clontech公司 ddH2O 300.0SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp)(Clontech公司 10.020 5.0ddH2O 100.0 5塊平板(90-50%PEG4000Sigma公司wt.=3,350)，用前抽濾或高壓蒸汽滅菌100% (Sigma公司10TE:0.1MTris-HClpH7.5)，10mMEDTA，高壓蒸汽滅菌10LiAc:1MLiAcpH7.5，高壓蒸汽滅菌10Dropout/Trp-Leu溶液3.2gDOSupplement(-Leu-Trp)500mlddH2O中;20Leu:200mgL-Leucine(Sigma公司)100mlddH2O中;0.2%Adenine:0.2gAdenineHemisulfateSalt(Sigma公司)100mlddH2O中;ddH2O:高壓蒸汽滅菌;二.250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（16-18hr，至OD6001.5；2500rpm5min25-50mlddH2OTE重懸洗滌酵母沉感受態(tài)細胞（若僅用于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，則可置于4C可幾天內(nèi)使用；101050%A.1.50150150/l.20B.1.20120120/C.1.00100// SpermDNA*(10mg/ml) *SpermDNA20分鐘，立即插入冰浴，保存于-30min；冰浴冷卻1-2min；一.YPD(Clontech公司 ddH2O 300.0SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp)(Clontech公司 10.0ddH2O 100.0 5塊平板(90-SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp-His-Ade)(Clontech公司 10.0ddH2O 100.0X-α-GAL(20mg/ml)，鋪5塊平板(90-100mm)；50%PEG4000Sigma公司，wt.=3,350)100% (Sigma公司(10Dropout/Trp-Leu溶液3.2gDOSupplement(-Leu-Trp)500mlddH2O中；10Dropout/-Trp-Leu-His-Ade溶液:3.0gDOSupplement(-Trp-Leu-His-Ade)溶于500mlddH2O中；3-AT（5M）4.202g3-AT10mlddH2O,溫水浴(<50℃)溶解,無菌濾器過濾后分裝10個EP管,-20℃保存;dddH2O:高壓蒸汽滅菌二.250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（16-18hr，至OD6001.5；300mlYPDAOD600=0.2-2500rpm5min25-50mlddH2OTE重懸洗滌酵母沉

10 10 50% 1.50 150 150 l.20 2.00 200 200 1.00 100 900 用量 pGBKT7-53 T 0.1SpermDNA*(10 0.1*SpermDNA20分鐘，立即插入冰浴，保存于-30min；冰浴冷卻1-2min；一.

Base(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp)(Clontech公司 5.020 2.5 YPD(Clontech公司 300.0SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp)(Clontech公司 70.0 700.0 10550%PEG4000Sigma公司，wt.=3,350)100% (Sigma公司(10Dropout/Trp-Leu溶液3.2gDOSupplementLeu-Trp)500mlddH2O20Leu:200mgL-Leucine100mlddH2OddH2O:高壓蒸汽滅菌二.從SD/-Trp平板上挑取直徑2-3mm、攜帶pGBKT7-bait（小規(guī)模轉(zhuǎn)化的AH1091mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，振蕩50mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30C恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（16-18hr300mlYPDAOD600=0.2-0.3，30C恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6(約3hr);5000rpm5min，棄上清,25-50mlddH2OTE受態(tài)細胞 101050% 1.50150150/l.20 10/ 10//cDNA文庫質(zhì) 10mg/mlSperm *SpermDNA20分鐘，立即插入冰浴，保存于-PEG/LiAc勻)，迅速插入冰浴冷卻1-2min;涂布φ150mmSDTrp-Leu固體培養(yǎng)板（50塊12ul108ul附 YPDA或SD液體培養(yǎng)基擴增酵 YPDA液體培養(yǎng)基擴增酵母 TE或ddH2O洗滌酵母細 準 A. 1.50B. C. 1ml 分 B.AD C.Sperm 1TE/LiAc重懸感受態(tài)細 酵母感受態(tài)細 室溫離心后棄上 10.1TE重懸感受態(tài)細 鋪固體選擇培養(yǎng)基平 對照實驗一.

SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp-His-Ade)(Clontech公司 10.0 100.0121C15min505M3-AT（15mM）100ulX-α-GAL(20mg/ml),鋪5塊平板(90-100mm)甘 2.0M 二.,落數(shù)100，則：低于106則需重新轉(zhuǎn)化;平板，30C倒置培養(yǎng)3-5天至菌落出現(xiàn);SD/-Trp-Leu/X-α-GAL平板上，30C天，使同一酵母菌中幾種庫質(zhì)粒分離挑取再次顯蘭色菌落重復(fù)上一步育1-2天，顯蘭色的菌落即可用于質(zhì)粒提取鑒定。一.

SDBase(Clontech公司 10DO(-Leu- 10.020 5.0 100.0酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS100mMNaCl;10mMTris,pH8.0;1mM10%TritonX- 1.0N 二.12000rpm×10min1.5ml干燥DNA；以20-30ul無菌ddH2O重懸DNA，保存于-20℃。 二.溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜;將2.5ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37℃恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至rpm×10min，4℃，棄上清；重復(fù)此步驟1次;溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜(約12-14hr); 0.4M

(溶液Ⅱ：0.2MNaOH；1％SDS)10M 0.1 0.5 4.4(溶液Ⅲ：KAc緩沖液，3.0MK+;5.0MAc-) 300.0冰乙 57.5 142.5×(TE緩沖液：l0mMTris-Cl;1mM 1.0NHCl調(diào)pH 為37℃)水浴消化1-2hr; 本試驗?zāi)康氖菍⑽膸熨|(zhì)粒按酶切圖譜歸類，因此所用酶為高頻酶：HaeIIIAluI如下，在適當?shù)臏囟?通常為12-15℃)水浴8-14hr： 0×T4連接緩沖液 D．T4DNA連接酶 0.5MEDTA，pH8.01.0ul，755minCIP，然后苯酚：氯仿：異戊醇抽提，乙醇沉淀回收酶解DNA片段，再進行連接反應(yīng)。一.

YPD(Clontech公司 300.0SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp)(Clontech公司 10.0 100.0 5塊平板(90-SDAgarBase(Clontech公司 10DO(-Leu-Trp-His-Ade)(Clontech公司 10.0 100.0121C15min505M3-AT（15mM）100ulX-α-GAL(20mg/ml),鋪5塊平板(90-100mm)50%PEG4000Sigma公司wt.=3,350)，用前抽濾或高壓蒸汽滅菌100%DMSO(Sigma公司10TE:0.1MTris-HClpH7.5)，10mMEDTA，高壓蒸汽滅菌10LiAc:1MLiAcpH7.5，高壓蒸汽滅菌10Dropout/Trp-Leu溶液:3.2gDOSupplement(-Leu-Trp)500mlddH2O中;10Dropout/-Trp-Leu-His-Ade溶液:3.0gDOSupplement(-Trp-Leu-His-Ade)溶于500mlddH2O中;0.2%Adenine:0.2gAdenineHemisulfateSalt(Sigma公司)100mlddH2O中3-AT（5M）4.202g3-AT10mlddH2O,溫水浴(<50℃)溶解,無菌濾器過濾后分裝10個EP管,-20℃保存;ddH2O:高壓蒸汽滅菌;二.YPDA1-32-3mmAH1091ml恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（16-18hr，至OD6001.5;300mlYPDAOD600=0.2-0.3，30C恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6(約3hr);5000rpm5min25-50mlddH2OTE