分子生物學試驗設(shè)計報告綠色熒光蛋白的克隆表達——閔霞〔2023141241165〕〔2023141241095〕一、引言基因標記技術(shù)是近年來進展起來的分子生物學技術(shù)色熒光蛋白、藍色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白。綠色熒光蛋白〔greenfluorescentprotein，GFP〕是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當受到紫外或藍光激發(fā)時，GFP放射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子，發(fā)色團是其蛋白質(zhì)一級序列固有的。N的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重組合。承受重組DNADNADNA分子。在此根底上，這個雜合分子能夠在肯定的宿主細胞中進展擴增，形成大量的子代分子。本次試驗中，分子克隆質(zhì)粒載體所攜帶的外源基因是EGFP綠色熒光蛋白，試驗的最終目的是將EGFP基因插入表達載體pET-28aDNABamHI和NotⅠ兩種酶的雙酶切作用，從而獲得目的外源基因片段EGFP和表達載體pET-28a質(zhì)粒的DNAAmpIPTGLB觀看大腸桿菌能否在含有AmpIPTGLBEGFP菌的構(gòu)建效果二、主要路線：1DNA的提取2DNA3、酶切連接重組質(zhì)粒4、重組質(zhì)粒的擴增5PCR法鑒定陽性克隆6、目的熒光蛋白基因的表達11DNA的提取試驗原理：質(zhì)粒是一種染色體外的遺傳因子，大小在1kb~200kb之間，是具有雙鏈閉合環(huán)狀構(gòu)造的DNA分子，主要覺察于細菌、放線菌和真菌細胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制力量，能使子代保的補償。從大腸桿菌中抽提質(zhì)粒DNA的方法很多，可以在試驗中依據(jù)不同的需要承受不同的方DNA的根本原理是依據(jù)染色體DNA和質(zhì)粒DNA分子量的巨大差異而到達分別的。。十二烷基磺酸鈉〔SDS〕是一種陰離子外表活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使DNA，因而被各試驗室廣泛承受。抽提過程中在參加溶液II后，堿性條件使DNA的氫鍵斷裂，宿主染色體雙螺旋構(gòu)造解開而變性，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條鏈不會完全分別，當參加溶液III中和后，宿主DNA相對分子質(zhì)量大，還沒來得及復(fù)性，就在冰冷的條件下與SDSRNA等纏繞在一起而沉淀下來，而質(zhì)粒DNA由于能夠快速配對恢復(fù)原來的構(gòu)型而溶解在TE溶液或ddH2O中。試驗?zāi)康陌盐諌A法抽提質(zhì)粒DNA的原理和方法試驗儀器、材料、試劑1、儀器恒溫搖床，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，10、100、1000μL取液器各一支，臺式高速離心機，制冰機，漩渦器。2、材料：含有質(zhì)粒pEGFP-N3和質(zhì)粒pET-28a的大腸桿菌DH5αml塑料離心管EP管架微量取液器和取液器吸頭常用玻璃器皿〔如三角瓶、量筒、等〕3、試劑LB培育液:胰蛋白胨〔Tryptone〕10g，酵母提取物〔Yeastextract〕5g，NaCl5g，瓊脂〔固體培育基〕15g，用1NNaOHpH7.5。溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ氨芐青霉素(50mg/mL)抽提液〔飽和酚：氯仿：異戊醇=25：24：1〕作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性，有助于液相與有機相的分別。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。異戊醇防止抽提液起泡。無水乙醇 作用：除去DNA水化層，使DNA沉淀。70%乙醇 作用：純化質(zhì)粒DNA。TE緩沖液或ddH2O 作用：溶解DNA具體步驟質(zhì)粒擴增在含有質(zhì)粒pEGFP-N3和質(zhì)粒pET-28a的大腸桿菌DH5α平板菌落上挑取單菌落，分別接種于液體培育基中〔加氨芐青霉素4μg/m180r/min振蕩培育過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒1〕1.5mLEppendorf小管中，10000rpm×2min，棄上清液。2〕100μLI，漩渦器上充分混勻，在室溫下放置10min。200μL2~35min。參加150μL冰冷的溶液Ⅲ，蓋緊后，溫順顛倒3-5次使混勻，產(chǎn)生白色絮狀物，冰上放15min。5〕10000rpm×5min，取上清液于另一干凈的離心管中。向上清液中參加等體積〔約40μ〕異戊醇22，v/，振蕩混勻，10000rpm×10min，將上清液轉(zhuǎn)移至的離心管中。參加等體積〔約37μ〕氯仿異戊醇24:10000rpm×2min,離心管中。2倍體積無水乙醇，混勻，-201h。9〕12023rpm×5min，倒去上清液，吸干液體。800μL70%乙醇，離心12023rpm×1min，倒盡上清液，吸水紙吸干液體，室溫自30min，直至變得透亮無乙醇味。20μLddH2O〔二次蒸餾水〕，混勻使DNA5μL做電泳檢測，剩余的溶液放置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼灲Y(jié)果推測1渾濁；參加溶液2變澄清；參加溶液3消滅白色絮狀沉淀；參加氯仿抽提溶液分層假設(shè)成功提取，需瓊脂糖凝膠電泳檢測之后才能觀看出結(jié)果。22、瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA試驗原理質(zhì)粒DNA在細胞內(nèi)有三種構(gòu)象：①共價閉環(huán)DNA，常以超螺旋形式存在；②假設(shè)兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消退鏈的張力，形成開環(huán)DNA；③線狀DNA，雙鏈DNA斷開成線狀。電泳時，三種構(gòu)象中，共價閉環(huán)DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環(huán)DNA。因此在本試驗中，質(zhì)粒在電泳中呈現(xiàn)2~3條區(qū)帶。試驗?zāi)康臋z驗是否獲得所需的質(zhì)粒試驗用品1、儀器電泳儀，電泳槽，樣品槽模板〔梳子成像系統(tǒng)。2、材料：提取的質(zhì)粒，瓊脂糖，錐形瓶，一次性手套，膠鏟，封口膜，剪刀，取液器吸頭。3、試劑：Goldview〔DNA染料〕1×TAE緩沖液上樣緩沖液〔6×〕具體步驟瓊脂糖凝膠板制備稱取0.3g30mL1×TAE緩沖液，微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。待膠液冷卻到6℃〔不燙手為宜，參加1μLGoldview混勻，攪拌器上攪拌排解氣泡，〔如右圖〕緩慢倒入事先預(yù)備的制膠有機玻璃槽〔插入樣品槽模板梳子〕內(nèi)。靜置30min左右，輕輕晃動拔出梳子。加樣膠板放入電泳槽中〔樣品孔位于負極，注入×TAE緩沖液漂浮過膠板5m器將提取的質(zhì)粒DNA5μL1μL上樣緩沖液〔6×〕混勻，參加膠板的樣品小槽內(nèi)。電泳100V1~2cm處，停頓電泳。觀看和拍照將膠板留神取出，放入凝膠成像系統(tǒng)中，調(diào)整位置居中，波長為254nm的紫外燈下，觀看凝膠中DNA存在處顯示出熒光條帶。留意事項凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相全都，溶解的凝膠應(yīng)準時倒入板中，避開倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避開消滅氣泡，影響電泳結(jié)果。用移液槍將樣品加至點樣孔，吸取每一個樣品時，操作要穩(wěn)當且細心。電泳一般是在追蹤染料泳動到膠的80%以防止液體蒸發(fā)，又可以降低電擊的可能性。33、酶切連接重組質(zhì)粒試驗原理DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。由于這種切割作用是在分子內(nèi)部進展的，故名限制性內(nèi)切酶BamHⅠ切割識別序列后產(chǎn)生的粘性末端：5”?G↓GATCC?3”→5”?G GATCC??3”3”?CCTAG↑G?5→3”?CCTAG G??5”NotI切割識別序列后產(chǎn)生的粘性末端：5”?GC↓GGCCGC?3”→5”?GC 3”?CGCCGG↑CG?5”→3”?CGCCGG CG??5雙酶切重組質(zhì)粒試驗試劑材料：試驗一提取的質(zhì)粒pEGFP-N3pET--28a，0.2ml管，取液器吸頭，一次性手套NotI,BamHI,ddH2O，10×buffer，引物、瓊脂糖，Goldview箱試驗步驟0.2mlEP管做上標記：如①②①號管②號管質(zhì)粒pET-28a：15①號管②號管質(zhì)粒pET-28a：15μlpEGFP-T1：15μl水9μl9μl10xBuffer3μl3μlNotI1μl1μlBamHI2μl2μl將兩只EP管混勻后瞬時離心，放入恒溫培育箱37℃酶切1h。取5uL①②EP5uL原質(zhì)粒溶液作比照，進展電泳檢測酶切結(jié)果。依據(jù)回收試劑盒〔OMEGA〕步驟切膠回收所需酶切產(chǎn)物片段。1〕需進展回收的凝膠，必需在穎的TAE緩沖液中進展電泳2〕1.5mlEP管稱重記錄其重量電泳完畢后，凝膠成像系統(tǒng)中觀看目的條帶所在位置，用干凈銳利的解剖刀切割所需回收的DNA條帶〔盡量不要切到多余的凝膠，放入已稱重EP重量。依據(jù)1g1mlBingingBuffer〔XP2〕計算，假設(shè)是0.3g0.3mlBingingBufferXP，總體積最好不要超過700u。裝有凝膠的EP55-6010min，期間不時搖擺直至凝膠完全溶解。HiBindDNAcolumn2mlcollectiontubeHiBindDNAcolumn10000×g1min700ul，請分成同等的兩份，分別參加兩個HiBindDNAcolumn。將collectiontube中的液體倒掉，仍舊將HiBindDNAcolumn放回剛剛的collectiontube中。再參加300ulBingingBuffeXP，室溫下100×g離心1mi，以便清洗HiBindcolumn，再次將中的液體倒掉。700ulSPWWashBuffer10000×g1min。棄掉collectiontube中的液體。將HiBindDNAcolumncollectiontube中。8步驟。棄掉collectiontube中的液體，將HiBindDNAcolumncollectiontube中，室溫下13000×g20min，甩干HiBindDNAcolumn中的膜。HiBindDNAcolumn1.5mlEPHiBindDNAcolumn30-50ulElutionBuffer〔DNA估量產(chǎn)量進展調(diào)整1mi。13000×g1min，洗脫DNA，1.5mlEP管中的液體即為回收的目的DNA片段。50ul進展電泳，檢測DNA含量。0.2mlEP管中10×0.2mlEP管中10×buffer酶切后的pET-28a酶切后的熒光蛋白基因T4DNA連接酶〔考慮鏈接效率〕2.5ul7.5ul13ul2ulX:Y=1:10-3025ul44重組質(zhì)粒的擴增試驗原理DNA的生理狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA0℃，在有CaCl2存在的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附42℃短時間熱擊處理，促進細胞吸取DNA復(fù)合物。試驗?zāi)康臄U增重組質(zhì)粒試驗步驟DH5a200ul解凍的感受態(tài)細胞參加整管連接30min。421min5min。再在感受態(tài)細胞混合物中參加0.8mlLB371h。1h6000r/min離心3mi，去掉上清液〔約留200ul的培育液，搖勻菌塊。Kana的LB固定培育基上，正置培育皿半小時后，37℃培育箱中倒置培育皿過夜。其次天早上觀看結(jié)果。5.5.菌落PCR法鑒定陽性克隆T7啟動子正向引物：5’-taatacgactcactataggg-3T7啟動子反向引物：5’-tgctagttattgctcagcgg-30.2mlEP25ulPCR5個：反響物反響物210×BufferDdHOMgCl24×dNTP1Taq酶菌落體積〔ul〕18.52.51.510.50.50.5挑一個用滅菌槍頭挑單菌落接觸EP管內(nèi)，混勻瞬時離心放入PCR儀中，設(shè)置反響程序：1〕94℃預(yù)變性5min2〕9430S3〕5530S4〕721min5〕2-430次6〕7210min9ul1ul10×loadingBuffer做電泳檢測，分析所得目的片段的大小，檢測是否與理論目的基