QQ2(R1)

分析方法的驗(yàn)證Q目錄1.概述為什么要進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證？保證藥品安全、有效、質(zhì)量可控是藥品研發(fā)和評(píng)價(jià)應(yīng)遵循的基本原則，其中，對(duì)藥品進(jìn)行質(zhì)量控制是保證藥品安全有效的基礎(chǔ)和前提。為達(dá)到控制質(zhì)量的目的，需要多角度、多層面來控制藥品質(zhì)量，也就是說要對(duì)藥品進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目測(cè)試，來全面考察藥品質(zhì)量。一般地，每一測(cè)試項(xiàng)目可選用不同的分析方法，為使測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對(duì)所采用的分析方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以充分表明分析方法符合測(cè)試項(xiàng)目的目的和要求，這就是通常所說的對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。1.概述為什么要進(jìn)行分析方法的驗(yàn)證？方法驗(yàn)證的目的是判斷采用的分析方法是否科學(xué)、合理，是否能有效控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。從本質(zhì)上講，方法驗(yàn)證就是根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗(yàn)證內(nèi)容，并通過設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來驗(yàn)證所采用的分析方法能否符合檢測(cè)項(xiàng)目的要求。方法驗(yàn)證在分析方法建立過程中具有重要的作用，并成為質(zhì)量研究和質(zhì)量控制的組成部分。只有經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法才能用于控制藥品質(zhì)量，因此方法驗(yàn)證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.1

引言本指導(dǎo)原則討論了在歐盟、日本和美國(guó)提交的新藥注冊(cè)申請(qǐng)資料中分析方法驗(yàn)證這一部分需要考慮的特性。本指導(dǎo)原則不一定涵蓋在世界其他地區(qū)的藥品的注冊(cè)或出口所要求的驗(yàn)證。分析方法驗(yàn)證的目的是為了證明該分析方法與其預(yù)期目的相適應(yīng)。2.2

需要驗(yàn)證的分析方法類型鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)定量試驗(yàn)雜質(zhì)限度試驗(yàn)原料藥或制劑中活性成分以及制劑中選定組分的含量測(cè)定2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.3

典型的驗(yàn)證參數(shù)準(zhǔn)確性（Accuracy）精密度（Precision）重復(fù)性（Repeatability）中間精密度（Intermediate

Precision）專屬性（Specificity）2.

分析方法驗(yàn)證：正文檢測(cè)限（Detection

Limit）定量限（Quantitaion

Limit）線性（Linearity）范圍（Range）注意：-

表示該項(xiàng)目通常不需要評(píng)價(jià)；+表示該項(xiàng)目需要評(píng)價(jià)；(1)

假如已評(píng)價(jià)重現(xiàn)性，可不需要再評(píng)價(jià)中間精密度；(2)

缺乏專屬性的分析方法，應(yīng)由其他分析方法來作補(bǔ)充;(3)

某些情況下可能需要；2.4下列情況需要重新驗(yàn)證：原料藥合成方法的改變制劑組分的改變分析方法的改變需要重新驗(yàn)證的程度應(yīng)根據(jù)改變的情況而定，某些其他的改變可能也要求驗(yàn)證。2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.5

術(shù)語(yǔ)表分析方法（Analytical

procedure）分析方法指的是進(jìn)行分析的方式，應(yīng)詳細(xì)描述進(jìn)行每個(gè)分析試驗(yàn)所必需的步驟。它包括（但不限于）：樣品、參比物、試劑的制備、儀器的使用、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、計(jì)算公式的運(yùn)用等。準(zhǔn)確性（Accuracy）準(zhǔn)確性指的是真實(shí)值或認(rèn)可的參考值與測(cè)量值之間的相近程度。準(zhǔn)確性有時(shí)也稱為真實(shí)度。2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.5

術(shù)語(yǔ)表專屬性（Specificity）專屬性是指在一些可能存在的組分如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、基質(zhì)等的存在下，對(duì)被分析物質(zhì)的準(zhǔn)確可靠的測(cè)定。一種分析方法缺乏專屬性時(shí)，應(yīng)由其他分析方法作補(bǔ)充。專屬性有以下含義：（1）定性鑒別（2）純度檢查（3）含量測(cè)定（含量或效價(jià)）2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.5

術(shù)語(yǔ)表精密度（Precision）精密度指的是規(guī)定條件下對(duì)同一均質(zhì)樣品多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)結(jié)果的一致程度（離散程度）。精密度可以從三方面考慮：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。精密度考察應(yīng)使用均質(zhì)的、可信的樣品。如果得不到，可用人為配制的樣品或樣品溶液進(jìn)行研究。分析方法的精密度通常以多次測(cè)量結(jié)果的

方差、

標(biāo)

準(zhǔn)

偏

差

或

變

異

系

數(shù)

表示。2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.5

術(shù)語(yǔ)表精密度（Precision）重復(fù)性（Repeatability）

是

指在相同的操作條件下，在較短時(shí)間間隔內(nèi)的精密度。重復(fù)性也叫批內(nèi)分析精密度。中間精密度（Intermediate Precision）是指實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件改變，如不同日、不同操作人、不同儀器等情況下的精密度。重現(xiàn)性（Reproducibility）是指不同實(shí)驗(yàn)室之間的精密度（合作研究，通常用于方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化）。2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.5

術(shù)語(yǔ)表檢測(cè)限（Detection

Limit）某一分析方法的檢測(cè)限是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，但不一定要準(zhǔn)確定量。定量限（Quantitation

Limit）某一分析方法的定量限是指在合適的準(zhǔn)確度和精密度下，能夠定量測(cè)定樣品中被分析物的最低量。它是樣品中含量低的化合物定量測(cè)定的參數(shù)，特別適用于雜質(zhì)和/或降解產(chǎn)物的測(cè)定。2.

分析方法驗(yàn)證：正文2.5

術(shù)語(yǔ)表線性（Linearity）分析方法的線性是指在給定的范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果與樣品中被分析物的濃度（量）成比例關(guān)系的能力。范圍（Range）分析方法的范圍是指在樣品中被分析物的較高濃度和較低濃度之間的一個(gè)區(qū)間，并已證實(shí)在此區(qū)間內(nèi)，該方法具有合適的準(zhǔn)確性、精密度和線性。耐用性（Robustness）分析方法的耐用性是指在故意對(duì)分析方法的參數(shù)進(jìn)行微小變化后，方法仍能保持不受影響的能力，用于說明方法在正常使用時(shí)的可靠性。2.

分析方法驗(yàn)證：正文3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.1

引言目的：對(duì)每一種分析方法中參數(shù)的驗(yàn)證提供指導(dǎo)和建議。申報(bào)中建立數(shù)據(jù)的表示方式。注意：在整個(gè)方法學(xué)驗(yàn)證中，必須采用經(jīng)過完全確認(rèn)的、純度已知的參比物質(zhì)來驗(yàn)證。參比物質(zhì)的純度要求與使用目的應(yīng)一致。3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.2

專屬性鑒別通過與參比物（結(jié)構(gòu)相同）比較得到陽(yáng)性/陰性結(jié)果。通過與被測(cè)物結(jié)構(gòu)相似或相關(guān)物質(zhì)比較得不到陽(yáng)性結(jié)果。含量測(cè)定和雜質(zhì)檢查色譜方法使用具有代表性的色譜圖來證明專屬性（標(biāo)出每一成分）分離度——專屬性的標(biāo)準(zhǔn)非專屬性方法 使用其他支持性分析方法來輔助證明專屬性3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.2

專屬性非專屬性方法含量測(cè)定和雜質(zhì)試驗(yàn)的方法是類似的：1）可得到雜質(zhì) 用加入法；2）得不到雜質(zhì)

可以通過比較包含雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的樣品的測(cè)試結(jié)果和另一個(gè)性能良好的分析方法，如藥典方法或其他有效的分析方法（單獨(dú)的方法）——對(duì)于含量測(cè)定，應(yīng)該比較這兩種結(jié)果；——對(duì)于雜質(zhì)試驗(yàn)，應(yīng)該比較雜質(zhì)的圖形；3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.3

線性應(yīng)該在分析方法的范圍內(nèi)評(píng)價(jià)線性關(guān)系?？梢杂弥付ǖ姆椒?，直接證明原料藥（通過標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液）的線性和/或混勻的制劑組分各自所占的比例來證明其線性。線性應(yīng)該可通過被測(cè)物濃度或含量的信號(hào)圖作出直觀評(píng)價(jià)。如果存在線性關(guān)系，測(cè)試結(jié)果應(yīng)該通過合適的統(tǒng)計(jì)方法來評(píng)價(jià)。原料藥（標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液）/混勻的制劑組方 至少5個(gè)濃度系列 測(cè)定采集信號(hào)統(tǒng)計(jì)（線性關(guān)系或函數(shù)關(guān)系）3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.4

范圍范圍通常是從線性研究得出的，并取決于分析方法預(yù)定的應(yīng)用。通過驗(yàn)證分析方法提供的線性、準(zhǔn)確度和精密度的可接受度建立范圍。最小的規(guī)定范圍對(duì)原料藥或制劑的含量測(cè)定通常是測(cè)試濃度的80%~120%對(duì)于含量均勻度 70%~130%對(duì)于溶出度 規(guī)定值的±20%3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.4

范圍最小的規(guī)定范圍對(duì)于雜質(zhì)檢查為報(bào)告的雜質(zhì)水平至所訂限度的120%對(duì)于產(chǎn)生毒性或無預(yù)期藥理作用的雜質(zhì)制的水平相當(dāng)檢測(cè)/定量限應(yīng)該與雜質(zhì)控如果含量和純度測(cè)試作為一個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行，且只有用到一個(gè)100%的標(biāo)準(zhǔn)品，線性應(yīng)該覆蓋從雜質(zhì)報(bào)告水平到含量分析規(guī)格的120%3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.5

準(zhǔn)確度在含量測(cè)定中原料藥用分析方法測(cè)定已知純度的被測(cè)物將該法與另一成熟方法比較，得到的準(zhǔn)確度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和/或定義從已經(jīng)建立的精密度、線性和專屬性項(xiàng)中推導(dǎo)準(zhǔn)確度制劑用分析方法測(cè)定已加入已知量的待分析物的藥物制劑組分的混合物在制劑中加入已知量主藥或與另一成熟方法比較，得到的準(zhǔn)確度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和/或定義從已經(jīng)建立的精密度、線性和專屬性項(xiàng)中推導(dǎo)準(zhǔn)確度3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.5

準(zhǔn)確度在雜質(zhì)的定量測(cè)定中用已知量的雜質(zhì)加入樣品中（原料藥/制劑）來評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。在不能獲得某種雜質(zhì)/降解產(chǎn)物的情況下，與采用其他方法測(cè)得的結(jié)果比較，可以使用原料的響應(yīng)值申報(bào)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)需在指定范圍內(nèi)至少3個(gè)濃度水平上進(jìn)行至少9次測(cè)定，例如用總分析方法測(cè)定3個(gè)濃度，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)樣品3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.6

精密度重復(fù)性在指定范圍內(nèi)測(cè)9次（3種濃度/每種重復(fù)3次）在100%的測(cè)定濃度時(shí)測(cè)6次中間精密度確定隨機(jī)事件（日期、分析者、儀器等）對(duì)分析方法的精密度的影響重現(xiàn)性通過實(shí)驗(yàn)室之間試驗(yàn)的方式來評(píng)價(jià)申報(bào)數(shù)據(jù)應(yīng)該給出所考察的精密度的標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)）和置信區(qū)間3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.7

檢測(cè)限根據(jù)目測(cè)評(píng)價(jià)（用于儀器/非儀器）通過分析加入已知濃度的分析物的樣品并通過檢測(cè)分析物的最小水平來確定檢測(cè)限。根據(jù)信噪比（只適用于表現(xiàn)出基線噪音的分析方法）信噪比的測(cè)定，是通過比較測(cè)得的已知低濃度的樣品信號(hào)與空白樣品的信號(hào)，建立能夠監(jiān)測(cè)到被測(cè)物的最低濃度所得到的。

已知低濃度被測(cè)物的信

號(hào)

3

或

2空白樣品的信號(hào)

1

13.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.7

檢測(cè)限根據(jù)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差或斜率檢測(cè)限（LoD）可以表達(dá)成：LoD

=

3.3σ/Sσ為響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（通過空白樣品測(cè)背景響應(yīng)值或Y軸截距）S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（通過被測(cè)物的校正曲線求得）申報(bào)數(shù)據(jù) 應(yīng)提供檢測(cè)限和用于確定檢測(cè)限的方法。3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.8

定量限根據(jù)目測(cè)評(píng)價(jià)（用于儀器/非儀器）通過分析加入已知濃度的分析物的樣品并通過檢測(cè)分析物的最小水平來確定定量限。根據(jù)信噪比（只適用于表現(xiàn)出基線噪音的分析方法）信噪比的測(cè)定，是通過比較測(cè)得的已知低濃度的樣品信號(hào)與空白樣品的信號(hào)，建立能夠監(jiān)測(cè)到被測(cè)物的最低濃度所得到的。

已

知

低

濃

度

被

測(cè)

物

的

信號(hào)

10空白樣品的信號(hào)

13.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.8

定量限根據(jù)響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差或斜率定量限（LoQ）可以表達(dá)成：LoQ

=

10σ/Sσ為響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（通過一組空白樣品的分析或根據(jù)校正曲線）S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（通過被測(cè)物的校正曲線求得）申報(bào)數(shù)據(jù) 應(yīng)提供定量限和用于確定定量限的方法3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.9

耐用性對(duì)于方法參數(shù)的有意變動(dòng)，分析方法應(yīng)該表現(xiàn)為可靠穩(wěn)定。典型例子供試液的穩(wěn)定性提取時(shí)間在HPLC中的典型例子流動(dòng)相pH的變化流動(dòng)相組分的變化柱溫流速不同色譜柱（不同批號(hào)/或不同生產(chǎn)廠家）3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.9

耐用性在GC中的典型例子不同色譜柱（不同批號(hào)/或不同生產(chǎn)廠家）柱溫流速如分析方法對(duì)分析參數(shù)的變化是敏感的，則該分析參數(shù)就應(yīng)適當(dāng)控制或在方法中注明。耐用性的結(jié)果應(yīng)該是建立一系列系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)（例如，分辨率測(cè)試），以確保分析方法的有效性在任何時(shí)候得到維持。3.

分析方法驗(yàn)證：方法學(xué)3.10

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)是許多分析方法必不可少的一部分。其概念是對(duì)分析方法和參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證以保證系統(tǒng)（儀器、數(shù)據(jù)工作站和分析操作要點(diǎn)和分析的控制點(diǎn)）能在使用時(shí)作為一個(gè)整體正確運(yùn)

行。建立的用于特定分析方法的系統(tǒng)適用性參數(shù)取決于要驗(yàn)證的方法類型，請(qǐng)查閱藥典以獲取更多信息。4.

國(guó)內(nèi)有關(guān)指導(dǎo)原則《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》2007年CDE頒布由于生物制品和中藥的特殊性，本原則主要適用于化學(xué)藥品。本指導(dǎo)原則重點(diǎn)探討方法驗(yàn)證的本質(zhì)，將分析方法驗(yàn)證的要求與所要達(dá)到的目的結(jié)合起來進(jìn)行系統(tǒng)和規(guī)律性的闡述，重點(diǎn)闡述如何科學(xué)合理地進(jìn)行論證方案的設(shè)計(jì)。本指導(dǎo)原則主要包括方法驗(yàn)證的一般原則、方法驗(yàn)證涉及的三個(gè)主要方面、方法驗(yàn)證的具體內(nèi)容、方法再驗(yàn)證、對(duì)方法驗(yàn)證的評(píng)價(jià)等內(nèi)容。4.

國(guó)內(nèi)有關(guān)指導(dǎo)原則4.1方法驗(yàn)證的一般原則原則上每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目采用的分析方法，均需要進(jìn)行方法驗(yàn)證。方法驗(yàn)證的內(nèi)容應(yīng)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，結(jié)合所采用分析方法的特點(diǎn)確定。同一分析方法用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目會(huì)有不同的驗(yàn)證要求。例如，采用高效液相色譜法用于制劑的鑒別和雜質(zhì)定量試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行不同要求的方法驗(yàn)證，前者重點(diǎn)要求驗(yàn)證專屬性，而后者重點(diǎn)要求驗(yàn)證專屬性、準(zhǔn)確度、定量限。4.

國(guó)內(nèi)有關(guān)指導(dǎo)原則4.2方法驗(yàn)證涉及的三個(gè)主要方面需要驗(yàn)證的檢測(cè)項(xiàng)目鑒別雜質(zhì)檢查（限度試驗(yàn)、定量試驗(yàn)）定量測(cè)定（含量測(cè)定、溶出度、釋放度等）：由于此類項(xiàng)目對(duì)準(zhǔn)確性要求較高，故所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準(zhǔn)確度和線性。其他特定檢測(cè)項(xiàng)目：包括粒徑分布、旋光度、分子量分布等4.

國(guó)內(nèi)有關(guān)指導(dǎo)原則4.2方法驗(yàn)證涉及的三個(gè)主要方面分析方法本指導(dǎo)原則所指分析方法是為完成上述各檢測(cè)項(xiàng)目而設(shè)定和建立的測(cè)試方法，一般包括分析方法原理、儀器及儀器參數(shù)、試劑、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)、供試品溶液制備、對(duì)照品溶液制備、測(cè)定、計(jì)算及測(cè)試結(jié)果的報(bào)告等。測(cè)試方法可采用化學(xué)分析方法和儀器分析方法。這些方法各有特點(diǎn)，同一測(cè)試方法可用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，但驗(yàn)證內(nèi)容可不相同。驗(yàn)證內(nèi)容：包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等。4.

國(guó)內(nèi)有關(guān)指導(dǎo)原則4.3方法再驗(yàn)證在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發(fā)生部分改變等，均有必要對(duì)分析方法再次進(jìn)行全面或部分驗(yàn)證，以保證分析方法可靠，這一過程稱為方法再驗(yàn)證。再驗(yàn)證原則：根據(jù)改變的程度進(jìn)行相應(yīng)的再驗(yàn)證。方法再驗(yàn)證是對(duì)分析方法的完善過程，應(yīng)根據(jù)實(shí)際改變情況進(jìn)行再驗(yàn)證，從而保證所采用的分析方法能夠控制藥品的內(nèi)在質(zhì)量。4.

國(guó)內(nèi)有關(guān)指導(dǎo)原則4.3方法再驗(yàn)證當(dāng)原料藥合成工藝發(fā)生改變時(shí)，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法的專屬性就需要再進(jìn)行驗(yàn)證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測(cè)新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對(duì)主成份的含量測(cè)定應(yīng)無干擾。當(dāng)制劑的處方組成改變、輔料變更時(shí)，可能會(huì)影響鑒別的專屬性、溶出度和含量測(cè)定的準(zhǔn)確度，因此需要對(duì)鑒別、含量測(cè)定方法再驗(yàn)證。當(dāng)原料藥產(chǎn)地來源發(fā)