第六次課細胞的復蘇、細胞周期測定、真核細胞轉(zhuǎn)染一、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。實驗七細胞的復蘇二、操作步驟1、準備一個37℃水浴箱（或一只茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水）。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中（預先加有10ml完全培養(yǎng)液），吹打均勻。4、1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。5、沉淀加適當培養(yǎng)基吹打均勻后，將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。流式細胞術(shù)（FlowCytometry簡稱FCM）是一種快速測定單個細胞物理、化學、生物特性的儀器。商品儀器的測量速度約每秒1000—3000個細胞，這種技術(shù)與現(xiàn)代一系列高技術(shù)的發(fā)展有密切關(guān)系。目前已可測量細胞的大小、體積、DNA含量、總蛋白、RNA含量、表面抗原、染色體、膜的完整性、DNA合成速率等。已廣泛用于細胞學、腫瘤學、遺傳學、免疫學、血液學和若干臨床的領(lǐng)域中，其應用的范圍有不斷擴大的趨勢。實驗七細胞周期測定什么是細胞周期

？由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，叫細胞周期。分為4個期：G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復制之前的間隙時間。S期(synthesisphase)，指DNA復制的時期。G2期(gap2)，指DNA復制完成到有絲分裂開始之前的一段時間。M期又稱D期(mitosisordivision)，細胞分裂開始到結(jié)束。EucaryoticCellCycle

Atypicalmammaliancellhasacellcycletimeof24hours,with12hrG1,6-8hrS,3-4hrG2,and1hrM（一）原理細胞通過用DNA結(jié)合染料進行染色，如PI。DNA圖示：能夠作出對細胞在細胞周期G1/G2，S和G2/M階段的產(chǎn)量的評估；不能很好地提供有關(guān)細胞通過細胞周期的運動信息；能夠較易地進行免疫熒光結(jié)合染色。碘化丙錠（PropidiumIodide，簡稱PI），為核酸嵌入型染料，可嵌入雙股螺旋多核苷酸結(jié)構(gòu)，故DNA和RNA均可著色。PI不能穿過活細胞膜，故活細胞拒染；但能穿過死細胞膜，使之著色。（二）試劑和器材

RNA酶APIC6細胞流式細胞儀

（三）操作步驟1．單細胞懸液用計數(shù)器計數(shù)后，取總數(shù)約2×106個細胞，用70%冷酒精，在4℃固定1天。2．離心1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，去上清，用PBS沖洗，打散、搖勻。3．再次離心，去上清，留0.2ml左右，加入RNA酶A，每個樣品要求加入3000—5000單位，37℃孵育30分鐘。4．將樣品放入冰中，冷卻后每個樣品加入大約1.5ml的PI（PI濃度為50μg/ml，用PBS溶解），再次放入冰中避光染色20分鐘。5．染色后的樣品在4小時內(nèi)上機測量，測試結(jié)果以DNA直方圖表示。6．有計算機軟件時，可做進一步的DNA分布分析。流式虜細胞截儀測模定細碰胞周漢期分輕期實夢驗結(jié)飄果一、謎原理將外紛源性帝基因(或基我因組DN嗎A)采用亮分子泰生物論學技諸術(shù)人鐵工地沉導入調(diào)細胞涼，觀渣察它咐在細武胞中煩的表六達，急研究好其生檢物學渡特性毫和功刷能，狂這種份把基遣因?qū)Ｈ爰毰浒幸频募贾g(shù)稱捆為基偽因轉(zhuǎn)衫導(g恥en帝e眼tr腥an廊sf錦er盡)或稱攻基因勺轉(zhuǎn)移漸，也展簡稱蛾為導揭入。詠是研鞭究基租因表言達、忍結(jié)構(gòu)忠和功刑能的吼重要脅研究悟手段馳。主要語方法言有：嶼磷酸盼鈣沉佛淀法價、電戴擊法盯、脂鋪質(zhì)體營法、緩顯微嘴注射研法、建逆轉(zhuǎn)筒錄病廣毒等率病毒靈介導橫法等爆。實驗溉八禾真禽核細承胞轉(zhuǎn)韻染脂質(zhì)仙體(li艙po倡fe冷ct丙inre宣ge詳an搞t,杰LR)試劑膠是陽雷離子歉脂質(zhì)內(nèi)體N-睡[1脹-2，3-金Di跡ol貓ey消ox侮y,Pr晝op冶yl葡]-然n,n,攻n-喪Tr圾im南et廚hy戀la球mm頂on屠iu環(huán)mCh委lo緒ri江de綠(D岔OT昨MA)和Di餐ol樂eo純ylph堅ot棋id束ye拐-t肺ha例no容la顫mi羞ne混(D橫OP涼E)的混朵合物[1主:1容(w化/w速)]。它集適用茶于把DN砍A轉(zhuǎn)染倦入懸派浮或職貼壁避培養(yǎng)瓣細胞以中，芒是目袍前條習件下僻最方吵便的柴轉(zhuǎn)染攔方法島之一賢。轉(zhuǎn)裂染率債高，季優(yōu)于普磷酸偶鈣法劉，比津它高5～10陣0倍，蹤蝶能把DN厲A和RN祖A轉(zhuǎn)染鈔到各椅種細艷胞。二、緩實驗娘材料1、宿瓣主細暈胞C6（貼洪壁細躬胞）2、脂豪質(zhì)體LI團PO興FE凳CT幅AM彩IN匯E漂20灑00（in傳vi平tr天og貢en公司罵）3、96孔細如胞培皂養(yǎng)板4、無摘血清潛培養(yǎng)窯基OP洗TI往-M震EM（GI炮BI聚CO）5、轉(zhuǎn)落染級阻質(zhì)粒三、棚操作魄步驟1、轉(zhuǎn)瓦染前附一天跟，以步合適艙的細塞胞密孕度接撇種到罪培養(yǎng)截板上疏。（鈔接種杜密度輸是3~奴4×105/m強l.）轉(zhuǎn)企染時傭，細余胞要圓達到90筆~9晚5%的融遍合。2、溶劫液1：25航ul無血肌清培行養(yǎng)基+辮0.鬼5ulli尚po蛙fe浸ct搏am禮in可e20鬼00暗p真er喇w撤el獲l（總汪體積25ul）（責溫育5m翁in）3、溶淚液2：Xul無血終清培弦養(yǎng)基+0令.2ug質(zhì)粒pe透r慘we撤ll（總蒸體積25ul）4、將詢?nèi)芤?與溶萍液2混合鄙，室家溫下社置20丑mi廣n。5、與駐此同銳時，蓄將細健胞用辣無血蒼清培鐮養(yǎng)基渡沖洗睡細胞變兩遍碑后，距加入10科0u朋l無血貍清培泉養(yǎng)基養(yǎng)。6、將犧溶液1與溶望液2的混流合液鞠逐滴撐加入貪孔中毯，搖奴動培訊養(yǎng)板鎖，輕午輕混篇勻。冶在37骨℃，5％的CO2中保因溫5~乖6小時漫。7、6小時汪后，當更換紋含有宗血清葡的全賭培養(yǎng)江基，蕩在37末℃，5％的CO2中48箱~7崗2h檢測維轉(zhuǎn)染它水平僑。四、正注意罩事項1.細胞宜的狀逃態(tài)：秋有文團獻說建傳代伙不要由超過17代。漠在細濤胞復犯蘇后抱的3代左賢右做嗽，那秀時細愿胞狀淚態(tài)最刷好，之不要比用傳謊了很檔多代邁的細伴胞去伶做，繡細胞謠的形辛態(tài)都足會發(fā)提生變扒化了隆。2.細胞熄的融跳合度皮：細普胞的醉融合懸度必世須要揉達到90坡%才能茂做，擦細胞察太少斜，容鋸易死炎。3.注意蠶洗的秤時候賄要輕儀，靠品邊緣紛緩緩命加入有液體拼，然篇后不階要吹拴吸細象胞，政而是春轉(zhuǎn)動植培養(yǎng)咬板讓收液體吳滾動霜在細棉胞表蔽面。朵如果弄洗的炎太厲腰害，偽細胞抬又損智失一煉部分撫，加染了脂勇質(zhì)體皺后，滋細胞直受影濱響就濟更大益了，犁死亡伐細胞星會增仗多。4.加入面無血例清培車養(yǎng)基疲后5~鼓6小時批更換征全培包養(yǎng)基選。無囑血清得培養(yǎng)延基培潤養(yǎng)時恨間過厭長，腐對細差胞是掠有毒妖性的下。5.轉(zhuǎn)染前的質(zhì)福粒一或定純懶度好魂、濃霧度高帝、無耗內(nèi)毒看素。慕濃度火不要椒低于0.忽35也